[發明專利]一種基于多巴胺脫羧酶催化產多巴胺的方法

在審

• 申請號: 201910257075.0
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109943582A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 陳可泉;程莎莎;高思遠;陸秋豪;許晟;王昕;張阿磊;楊賽;李孟陽;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種基于多巴胺脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，構建表達多巴脫羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；

步驟2，培養多巴脫羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；

步驟3，收集步驟2中的基因工程菌，用pH5-9的緩沖液重懸后，超聲破碎儀破碎；離心去除雜質，得到多巴脫羧酶的粗酶液；

步驟4，選取多巴作為底物，加入0.1-1mM磷酸吡哆醛，再添加緩沖溶液調節反應體系的pH至5-9，最后加入多巴脫羧酶粗酶液0.5-2g/l，40-45℃反應0.5h-3h，得到產物多巴胺，反應體系中底物多巴的終濃度不超過6g/l。

2.根據權利要求1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，步驟1中所述構建表達多巴脫羧酶的基因工程菌的方法如下 ：根據已報導的異色瓢蟲來源多巴脫羧酶（DDC）的氨基酸序列（GenBank: AMQ13055.1）進行密碼子優化后，全基因合成該序列，亞克隆到載體pET28a上，獲得重組質粒pET28a-DDC，將構建好的重組質粒pET28a-DDC用氯化鈣法轉化進入大腸桿菌表達宿主BL21（DE3），得到多巴脫羧酶表達菌種BL21（DE3）/pET28a-DDC。

3.根據權利要求1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，步驟2中基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC培養方法具體為：挑取表達多巴脫羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC的單菌落，接種于LB培養基，37℃培養至OD值達到0.6以上，再加入0.5mM的IPTG，18℃培養10-12小時，離心收集表達多巴脫羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC。

4.根據權利要求1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，步驟4中多巴的終濃度量為5g/l，磷酸吡哆醛的添加量為0.4mM，反應體系的pH為6.8-7.0，反應溫度為42℃，添加多巴脫羧酶粗酶液濃度為1g/l，反應時間為1h。

5.根據權利要去1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，步驟4中所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、PBS緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液中一種。

6.根據權利要求1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，步驟4中多巴作為底物，初始濃度為2g/l，分次加入反應體系，且終濃度不超過6g/l。

7.根據權利要求1所述的一種基于多巴脫羧酶催化產多巴胺的方法，其特征在于，所述步驟3中超聲破碎儀的功率為300W，破碎過程為間歇式破碎。