[發明專利]一種穩定表達絲氨酸蛋白酶的單克隆細胞株及其制備方法及含該細胞株的試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201910256904.3
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN110616216B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 周佳彬;鄭杰;米夢柔;候野;張凌云;陳曉娟
• 申請（專利權）人: 北京鼎持生物技術有限公司;珠海鼎安生物制品有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/85;C12N15/57;C12Q1/70;C12Q1/02
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 陳琳琳;張紅生

本發明公開了一種穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的單克隆細胞株及其制備方法及含該細胞株的試劑盒和應用。將穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的單克隆細胞株在培養板中培養，將細胞培養液去除；豬瘟病毒原液倍比稀釋并將稀釋后的病毒液加入去除細胞培養液的培養板中；繼續培養通過CPE的現象對豬瘟病毒TCID50進行判定，TCID50的計算方法按照Reed?Muench兩氏法進行計算。本發明用于豬瘟病毒的直觀檢測，利用該檢測試劑盒檢測豬瘟病毒的TCID50，不需要熒光顯微鏡和豬瘟檢測抗體，豬瘟病毒TCID50的結果判定簡單且實驗重復性好等優點。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體地，本發明涉及一種穩定表達絲氨酸蛋白酶的單克隆細胞株及其制備方法和含該細胞株的試劑盒。

背景技術

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV) 引起的一種高度接觸性傳染病，野豬和家豬是CSFV的唯一自然宿主，流行廣泛，發病率及死亡率較高，是威脅養豬業的重要疾病。因此，豬瘟的防控形勢嚴峻，針對豬瘟病毒及其疫苗研發的相關研究依然十分緊迫，所以開發出可以簡便經濟檢測豬瘟病毒滴度的檢測試劑盒對于豬瘟疾病的防控有著重要意義。

豬瘟病毒屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，病毒粒子略呈圓形，有囊膜，病毒粒子表面有纖突構造。CSFV為有囊膜的單股正鏈線狀RNA病毒，CSFV全長約為 12.3kb，其基因結構簡單，由兩端各一個非編碼區5'UTR和3'UTR以及中間的一個連續的大的開放閱讀框(ORF)構成。ORF能夠編碼由3898個氨基酸組成的獨立的多聚蛋白，在病毒及宿主蛋白酶的水解作用下形成12種蛋白質終產物，包括4種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)以及8種非結構蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)。豬瘟病毒的特征之一是在體外培養過程中不引起細胞病變，因此其與細胞之間的相互作用引起越來越多人的關注，而NS3作為非結構蛋白的一種，兼具絲氨酸蛋白酶(1/3NS3)、核苷三磷酸以及RNA解旋酶 (2/3NS3)活性。實驗結果表明，NS3蛋白的表達與致細胞病變有密切的關系，因此，對于NS3基因的研究有助于找出豬瘟病毒致細胞病變的原因。

豬瘟病毒感染豬睪丸細胞后，不能引起明顯的CPE現象，所以關于豬瘟病毒的TCID50值只能通過免疫熒光的檢測方式進行檢測。然而，使用免疫熒光的實驗方法檢測豬瘟病毒滴度具有檢測價格較貴、重復性差、需要熒光顯微鏡等缺點，因此，急需簡單有效的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的單克隆細胞株及其制備方法和含該細胞株的試劑盒，本發明構建了一株穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的穩定細胞株，利用該細胞株用做豬瘟病毒TCID50的檢測。

為達到上述目的，本發明采用了如下的技術方案：

一種穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的單克隆細胞株E-ST-50#，保藏號為CGMCCNo.17415，該細胞株為豬睪丸細胞。

一種穩定表達絲氨酸蛋白酶基因的單克隆細胞株的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

1)絲氨酸蛋白酶過表達質粒構建

擴增絲氨酸蛋白酶基因片段，以CSFV-DNS3為模板，使用引物CSFV-1/3NS3- NheI-F以及CSFV-1/3NS3-BstbI-R擴增帶有NheI以及BstbI兩個酶切位點的目的片段CSFV-1/3NS3，使用NheI以及BstbI同時酶切目的片段CSFV-1/3NS3以及質粒 PLJM1 RagB 99L獲得帶有粘性末端的目的片段以及載體，將絲氨酸蛋白酶基因片段插入到酶切過的PLJM1 RagB99L質粒中，構建得到PLJM1-CSFV-1/3NS3質粒；

2)ST細胞培養