[發(fā)明專利]一種調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910254708.2 | 申請(qǐng)日： | 2019-03-31 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN110066813B | 公開（公告）日： | 2021-01-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 杜娟;李澤華;劉穎麗;盧孟柱 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 浙江大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/53 | 分類號(hào)： | C12N15/53;C12N9/02;C12N15/82;C12N15/64;A01H6/00 |
| 代理公司： | 北京市廣友專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 11237 | 代理人： | 耿小強(qiáng) |
| 地址： | 310013 浙江*** | 國(guó)省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 調(diào)控 楊樹 木材 形成 油菜 內(nèi)酯 合成 限速 基因 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
2.權(quán)利要求1所述調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.包含權(quán)利要求1所述調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因的植物表達(dá)載體，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.構(gòu)建權(quán)利要求3所述調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因的植物表達(dá)載體的方法，其步驟如下：
(1)利用通路克隆技術(shù)構(gòu)建PagDET2基因的過量表達(dá)載體，使用特異PCR引物，以銀腺楊cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PagDET2基因CDS構(gòu)建到入門載體，入門載體為PDNOR207，序列如序列表中序列6所示；
反應(yīng)體系為Fresh PCR product 80ng；PDNOR207 vector 0.4μl；BP ClonaseⅡenzyme mix 0.6μl；無菌ddH2O補(bǔ)足至5μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃反應(yīng)5h，從篩選培養(yǎng)板上挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證；
(2)將帶有PagDET2基因的入門載體通過Mlu I限制性內(nèi)切酶線性化后，Gateway體系構(gòu)建至植物表達(dá)載體pMDC32，序列如序列表中序列7所示，進(jìn)行LR反應(yīng)；
反應(yīng)體系為：Linearized entry clone 50ng；purified destination vector 75ng；LR Clonase Ⅱenzyme mix 0.6μl；TE buffer，pH 8.0，補(bǔ)足5μl，反應(yīng)條件：25℃反應(yīng)5h，經(jīng)LR反應(yīng)后，PagDET2基因?qū)胫参锉磉_(dá)載體pMDC32中，在PagDET2基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S，使PagDET2基因在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)；在PagDET2基因的3’端組裝有強(qiáng)終止子NOS，有效終止PagDET2基因的轉(zhuǎn)錄，得到植物表達(dá)載體pMDC32-PagDET2；
(3)在載體質(zhì)粒上組裝潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT，作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選，在載體質(zhì)粒組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的PagDET2基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹受體染色體中，通過PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)過量表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pMDC32-PagDET2；其中，所述PagDET2基因?yàn)檎{(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述特異PCR引物為序列表中序列4所示CDS正向引物和序列表中序列5所示CDS反向引物。
5.權(quán)利要求1所述調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因的遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其步驟如下：
通過電擊法，將權(quán)利要求4中所構(gòu)建的pMDC32-PagDET2過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將PagDET2基因轉(zhuǎn)入楊樹；其中，所述PagDET2基因?yàn)檎{(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
6.權(quán)利要求1所述調(diào)控楊樹木材形成的油菜素內(nèi)酯合成限速基因在調(diào)控楊樹的木質(zhì)部生長(zhǎng)發(fā)育過程中的應(yīng)用。
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