[發明專利]一種高效清除細胞培養過程中支原體污染的配方

在審

• 申請號: 201910254467.1
• 申請日: 2019-03-31
• 公開（公告）號: CN110106135A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 劉繼來
• 申請（專利權）人: 南京千濟諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C07K14/00;C07K7/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明的高效清除細胞培養過程中支原體污染的配方，由抗菌肽BMAP?18和BMAP?18?R9組成，其中BMAP?18具有殺滅細胞外支原體的功能；BMAP?18?R9在R9穿膜肽的作用下進入到細胞中，殺滅細胞內的支原體。兩者相結合就可以徹底殺滅細胞內外的支原體。同時，這兩者單獨使用和聯合使用，200uM濃度內，對細胞沒有毒性作用。

技術領域

本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種清除細胞培養過程中支原體污染的配方。

背景技術

支原體是一種大小僅為0.2-0.3 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45um）的原核生物，在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體污染是一個世界性的難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般并未發生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺，最終，導致實驗結果重現性差等嚴重問題。

目前，已有文獻報道BMAP-18是一種抗菌肽可以清除常見的致病菌（https://doi.org/10.1016/j.peptides.2011.03.024），但是沒有報道其可以清除支原體。R9是由9個R組成的氨基酸序列，是一個人工設計的穿膜肽（CPPs）。我們通過實驗發現BMAP-18對細胞培養污染的支原體有一定的清除效果，但是無法做到100%的清除，可能的原因是BMAP-18無法清除細胞內部的支原體。因此，我們引入穿膜肽R9，將BMAP-18帶入到細胞內，達到徹底殺滅胞內支原體的目的。

鑒于此，我們設計并驗證了一種新的抗菌肽組合，可以作為清除細胞培養過程中支原體污染的有效。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是開發一種可以同時殺滅細胞內和細胞外支原體的抗菌肽配方。

本發明的抗菌肽配方，所述抗菌肽是由BMAP-18和BMAP-18-R9組合而成。其中的BMAP-18可以清除常見的致病菌和支原體。BMAP-18-R9不僅可以清除常見的細胞外致病菌和支原體，也可以同時清除細胞內常見的致病菌和支原體。所述抗菌肽BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式中所需要使用的附圖作簡單地介紹，其中：

圖1為本發明的BMAP-18清除胞外支原體的驗證實驗結果圖；

圖2為本發明的BMAP-18-R9清除胞內支原體的驗證實驗結果圖；

圖3為本發明的BMAP-18和BMAP-18-R9混合使用清除胞內支原體的驗證實驗結果圖；

圖4為本發明的BMAP-18和BMAP-18-R9細胞毒性實驗結果圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。試驗例中所涉及的BMAP-18和BMAP-18-R9，委托第三方公司采用化學合成方式獲得，稀釋成1M的儲存母液，-20℃保存備用。所用的陽性對照支原體種類為豬鼻支原體(M.Hyorhinis)。采用檢測方法為商業化的PCR檢測試劑盒。

試驗例1

本實施例的BMAP-18殺滅細胞外支原體的驗證步驟為：

1、將支原體污染的細胞上清棄去，PBS清洗三遍后，加入混入BMAP-18的完全培養基，使得終濃度為100uM；

2、連續培養三天，每天重復上一步操作1次；

3、連續培養四天，胰酶消化細胞并用PBS重懸，2000g離心20min；