[發明專利]基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201910249950.0
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN111751546A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 英哲;張睿;楊衛東;郝亞斌;孫寶明;劉放;王永鵬;曾尤;成會明
• 申請（專利權）人: 中國科學院金屬研究所;遼寧省腫瘤醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/48
• 代理公司: 沈陽優普達知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 21234
• 代理人: 張志偉

1.一種基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法，其特征是，包括如下步驟：

(1)石墨烯修飾電極的制備

將化學氧化法制備的氧化石墨烯分散于磷酸鹽緩沖溶液中形成穩定的分散液，將該分散液滴涂到經清潔后的玻碳電極上，氧化石墨烯修飾過的電極在室溫下干燥；

(2)為了提高修飾電極的穩定性，將步驟(1)制得的修飾電極繼續滴涂殼聚糖乙酸溶液；

(3)電極上氧化石墨烯的電化學還原

將步驟(2)制得的修飾電極作為工作電極放入摩爾濃度為0.05～0.2M磷酸鹽緩沖溶液中，與飽和甘汞參比電極和鉑片對電極構成三電極體系，在-1.5～0V電壓范圍內做循環伏安掃描，使氧化石墨烯還原成石墨烯，從而進一步提高電極的導電性及對鈣衛蛋白抗體的吸附性能，增大鈣衛蛋白抗體在電極上的吸附量；

(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺活化電極表面的羧基

將4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖溶液滴涂到步驟(3)制得的修飾電極上，并在室溫下活化1～3小時；

(5)修飾鈣衛蛋白抗體

將5～7μL濃度為25～300μg/mL的鈣衛蛋白抗體溶液滴加到步驟(4)制得的電極表面，于25～35℃恒溫箱中孵化0.5～2小時，用8～12mM的磷酸鹽緩沖溶液洗去未與電極結合牢固的鈣衛蛋白抗體；

(6)封閉電極非特異性活性位點

用4～6μL濃度為0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封閉步驟(5)制得電極的表面非特異性活性位點，于25～35℃恒溫箱中孵化0.5～2小時，用8～12mM的磷酸鹽緩沖溶液清洗掉未與電極結合牢固的牛血清白蛋白；

(7)修飾鈣衛蛋白

將5～7μL濃度為10～200ng/mL的一系列不同濃度的鈣衛蛋白用于和電極上抗體特異性識別，于25～35℃恒溫箱中孵化0.5～2小時，用8～12mM的磷酸鹽緩沖溶液清洗掉未與電極上抗體結合牢固的鈣衛蛋白，于4℃冰箱中儲存備用。

2.根據權利要求1所述的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(1)中，氧化石墨烯在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為0.05mg/ml～5mg/ml，修飾電極所用氧化石墨烯分散液用量為0.5～20μL。

3.根據權利要求1所述的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(1)中，氧化石墨烯在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為0.5～3mg/ml，修飾電極所用氧化石墨烯分散液用量為2～15μL。

4.根據權利要求1所述的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)中，殼聚糖乙酸溶液采用濃度為0.1～0.5wt％的殼聚糖乙酸溶液。

5.根據權利要求1所述的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(4)中，N羥基琥珀酰亞胺在磷酸鹽緩沖溶液中的摩爾濃度為100～200mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽在磷酸鹽緩沖溶液中的摩爾濃度為200～500mM。

6.一種權利要求1至5之一所述方法制備的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的應用，其特征在于，鈣衛蛋白生物傳感器用于檢測鈣衛蛋白，包括檢測糞便中的鈣衛蛋白、血清中的鈣衛蛋白或尿中的鈣衛蛋白。

7.根據權利要求6所述的基于石墨烯的鈣衛蛋白生物傳感器的應用，其特征在于，石墨烯修飾電極傳感器對鈣衛蛋白溶液濃度的檢測過程如下：

將修飾有鈣衛蛋白的電極與銀/氯化銀電極和鉑片電極構成三電極體系，以溶解于磷酸鹽緩沖溶液的摩爾濃度為1～3mM的鐵氰化鉀溶液為電解液，在電化學工作站上在-0.2～0.6V電壓范圍內做循環伏安掃描或差分脈沖伏安掃描，在循環伏安掃描或差分脈沖伏安掃描曲線上的峰電流隨鈣衛蛋白濃度呈規律性變化，從而實現對鈣衛蛋白濃度的檢驗。