[發明專利]金錢松的熒光PCR檢測試劑及方法

在審

• 申請號: 201910246628.2
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN110093437A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 張吉紅;徐瑛;王佳瑩;崔俊霞
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

本發明公開了金錢松的熒光PCR檢測試劑及方法，該熒光PCR檢測試劑引物序列分別為TTGTCTCTGC ATTTGGATTC GT和CCTGCTCCCT GGCGATTA，探針序列為TGCCCCTTCG TTGCGTGATG C，探針含有FAM熒光報告基團，檢測方法樣品DNA提取、熒光PCR檢測和鑒別，該熒光PCR檢測試劑對金錢松特異性和靈敏性，該檢測方法可以快速檢測金錢松，尤其是形態學難以鑒別的落葉階段，10^?1～10^?5倍稀釋液樣本均能夠得到典型擴增曲線。

技術領域

本發明涉及金錢松的鑒定，具體涉及金錢松的熒光PCR檢測試劑及方法。

背景技術

金錢松屬松科金錢松屬，為我國特有的單種屬植物，被列入中國珍稀瀕危保護植物名錄，屬于國家Ⅱ級重點保護物種，金錢松不僅是重要的庭院植物，同時也是一種應用前景廣泛的藥用植物。寧波口岸每年出口金錢松盆景約6000盆，目前查驗以形態學鑒定為主，而出口季節為冬季落葉階段，因此急需制定形態學和分子生物學相結合的《金錢松鑒定方法》，為進出境物種資源查驗工作提供執法技術支持。目前金錢松的分子生物學研究以分析其遺傳多樣性為主，尚無分子生物學鑒定方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種金錢松的熒光PCR檢測試劑及方法，該熒光PCR試劑可以快速、特異、靈敏鑒定金錢松，尤其是形態學難以鑒別的落葉階段。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：金錢松的熒光PCR檢測試劑，該熒光PCR檢測試劑引物和探針的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5′-TTGTCTCTGCATTTGGATTCGT-3′

下游引物：5′-CCTGCTCCCTGGCGATTA-3

探針：5′-FAM-TGCCCCTTCGTTGCGTGATGC-Eclipse-3′。

引物和探針是根據GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih. gov)中已登錄的金錢松的基因序列-內源基因參照SN/T 1204-2016中18SrRNA序列，采用Blast程序進行同源性比較，在同源性序列的高度保守區采用Primer Express 3.0軟件設計得到金錢松的特異性引物與探針，探針5′端含有FAM熒光報告基團，3′端含有不發熒光的淬滅基團Eclipse。

利用金錢松的熒光PCR檢測試劑檢測金錢松的方法，其步驟如下：

樣品DNA提取：取100mg粉樣于1.5mL離心管中，加入600μL CTAB提取液，充分振蕩混勻，65℃水浴30min，不時顛倒混勻；然后10000r/min離心5min，取上清，上清用該上清等體積的氯仿異戊醇混合液抽提，抽提完畢取上清，加入該上清2倍體積CTAB沉淀液，室溫沉淀1h，12000r/m離心10min，棄上清；加入350μL NaCl飽和溶液溶解沉淀，再用350μL氯仿異戊醇混合液抽提，取上清，上清中再加入該上清等體積的異丙醇，4℃沉淀至少10min，然后12000r/m離心10min，棄上清；質量濃度70%的乙醇洗滌1～2次，晾干后，加入100μL TE緩沖液溶解沉淀，得到樣品DNA模板，4℃保存備用，上述氯仿異戊醇混合液中三氯甲烷:異戊醇體積比為24:1；

熒光PCR檢測：取樣品DNA模板4μL，加入下述檢測試劑：Probe qPCR Master Mix-2×緩沖液10μL，濃度為10μmol/L上游引物0.4μL，濃度為10μmol/L上游引物0.4μL，濃度為10μmol/L探針0.8μL，ROX0.4μL，用純水補至20μL；50℃去污染2 min，檢測反應參數為：預變性95℃ 10min；95℃ 15s, 60℃ 30s，40個循環；

鑒別：熒光PCR檢測有熒光響應則為金錢松，也可以進一步分析擴增曲線，有典型的擴增曲線就為金錢松。