[發明專利]一種同時檢測5個磺胺類耐藥基因的多重液相基因芯片引物、試劑盒及其分析方法

在審

• 申請號: 201910245722.6
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109762917A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 徐鳳姣;閔凡貴;王靜;黃韌
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6837;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

本發明公開了一種同時檢測5個磺胺類耐藥基因的多重液相基因芯片引物、試劑盒及其分析方法，旨在提供一種操作簡單，能夠同時檢測磺胺類耐藥基因int1，sul1，sul2，sul3和sul4而且具有靈敏度高，準確率高，可實現同一樣本中的多種不同目的分子同時進行檢測引物、試劑盒及其分析方法；其技術方案包括引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1?SEQ ID NO：10所示的引物；本發明屬于細菌耐藥性檢測領域。

技術領域

本發明屬于實驗動物的病原檢測領域，具體涉及一種同時檢測磺胺類耐藥基因int1，sul1，sul2，sul3和sul4的多重液相基因芯片分析方法及試劑盒。

背景技術

沙門氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌是重要的致病菌，由于抗生素大規模不合理的使用，使得這些致病菌出現了嚴重的多重耐藥性，導致大部分現有藥物無效。由質粒介導的耐藥基因可傳遞給其他動物和人類，在給養殖業造成了嚴重經濟損失的同時，也影響著食品安全和人類健康。

Ⅰ類整合子(int1)作為可移動的DNA片段，能夠捕獲外源耐藥基因并將耐藥基因水平傳播，對細菌的耐藥性傳播有非常重要的意義。致病菌對磺胺類廣泛耐藥與磺胺類耐藥相關基因sul1、sul2、sul3和sul4基因有關。sul1基因常與其他耐藥基因整合到Ⅰ類整合子上，sul2基因常位于非接合性質粒或可移動多重耐藥質粒上，sul3和sul4是新近發現的磺胺類耐藥相關基因。傳統的表型檢測采用藥敏試驗方法及自動化藥敏檢測方法，該方法以細菌培養為基礎，能直觀反應病原菌對某種藥物敏感或耐藥，但藥敏結果報告較慢，經驗依賴性強，操作繁瑣，不能完全適應臨床治療的需要。

現有的磺胺類耐藥基因檢測主要靠普通單重PCR和多重PCR。已報道的針對大腸桿菌和沙門氏菌的多重PCR(int1、sul1、sul2、sul3)檢測耐藥基因，產物片段大小從/285bp到898bp不等，沒有對多重PCR的靈敏度做探討，存在較高的漏檢風險。而且，無論是單重還是多重PCR技術，其結果判定都需要凝膠電泳，費時費力，在實際應用中遇到樣品量大的情況，很難滿足檢測需求。

另外，隨著磺胺類耐藥基因sul4的發現，目前國內還未見到一種能同時檢測5種磺胺類耐藥基因的檢測方法，也未見有應用多重免疫熒光分析方法檢測磺胺類耐藥基因的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種靈敏度高，準確性好，同時檢測磺胺類耐藥基因int1，sul1，sul2，sul3和sul4的多重液相基因芯片分析引物對。

為此，本發明提供的第一個技術方案為：

一種同時檢測5個磺胺類耐藥基因的多重液相基因芯片引物，所述的5個磺胺類耐藥基因分別為：int1，sul1，sul2，sul3和sul4；其中：

int1檢測引物對：P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，P2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

sul1檢測引物對：P3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，P4核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

sul2檢測引物對：P5核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，P核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

sul3檢測引物對：P7核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；P8核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

sul4檢測引物對：P9核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；P10核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示。

優選的，上述的同時檢測5個磺胺類耐藥基因的多重液相基因芯片引物，

所述引物P1和P2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物P3和P4其中一條引物的5’端被生物素化；