[發明專利]一種包含戊型肝炎病毒復制子的人肝癌細胞系、應用及構建方法

有效

• 申請號: 201910245093.7
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109913424B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 黃耀偉;徐令東
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N7/00;C12Q1/02;C12N15/88;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種包含戊型肝炎病毒復制子的人肝癌細胞系、應用及構建方法。所述人肝癌細胞系命名為人肝癌細胞Huh7?EZ，保藏號為CCTCC NO：C2018193。本發明通過通過分子克隆以及反向遺傳技術，對病毒的基因組進行了改造，將EGFP/zeocin基因替換了HEV的編碼衣殼蛋白的基因，通過添加博萊霉素篩選，得到了一株支持HEV復制子持續復制的Huh7細胞系，命名為人肝癌細胞Huh7?EZ，該細胞對研究HEV致病機理及挖掘新型抗病或篩選新的抗病毒藥物具有重要意義，為HEV的研究提供一個新的模型。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，特別是涉及一種包含戊型肝炎病毒復制子的人肝癌細胞系、應用及構建方法。

背景技術

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是引起戊型肝炎的病原體，而戊型肝炎是目前急性肝炎的主要病因之一。戊型肝炎病毒的目標人群是15-40歲的青壯年。臨床癥狀為典型的急性、病毒性肝炎癥狀，包括黃疸、全身乏力、食欲不振、惡心、腹痛、發熱、肝腫大等；無黃疸的肝炎也有過報道。

該病最早于1955年在印度的新德里爆發，目前HEV廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲的大部分地區。根據流行性和散發性疾病的報道，估計有20億人生活在戊型肝炎流行的地區。所有流行地區共同的特征是飲用水被污染，病毒經由糞口途徑感染人群或動物。由于其特定傳播途徑，導致戊型肝炎在許多公共衛生條件較差的發展中國家是一個重要的公共健康疾病。但在包括日本、美國以及歐洲的許多發達工業化國家中也有散發和群發案例。戊型肝炎在人口中的致死率是0.2-1％。但不同于其它病毒性肝炎，它的一個獨特的臨床特點是孕婦感染HEV的死亡率高達30％。同時在免疫抑制患者中可出現HEV的慢性感染。

哺乳動物HEV主要分為4個基因型，基因型1和基因型2的感染對象限制為人，基因型3和基因型4為人畜共患，包括豬、鹿等在內的動物都是HEV的宿主。

目前，HEV是急性肝炎主要的致病原因，且由于該病毒目前缺少有效的細胞培養系統，治療HEV藥物的研發存在困難，尚沒有很好的藥物可以用于治療HEV。

HEV是一種單股正鏈RNA病毒。HEV的基因組包含3個開放性的閱讀框，ORF1編碼非結構蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白，ORF3編碼一個小的多功能蛋白。

HEV的非結構蛋白由ORF1編碼，這個編碼區域在非編碼區的5’端開始，ORF1編碼了一個含有1693個氨基酸的多肽鏈，這個多肽鏈與病毒的復制和蛋白質加工有關。ORF1包含了幾個功能區域，包括病毒RNA基因組帽子5’端的甲基轉移酶(Met)區域、功能未知的“Y”區域，木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PCP)區域、在一個富含脯氨酸區域中包含高變區(HVR)、在PCP區域旁邊的功能未知的“X”區域、解旋酶(Hel)區域以及負責病毒復制的RNA依賴的RNA聚合酶區域。

ORF2編碼了HEV的衣殼蛋白，有660個氨基酸，功能是使病毒核酸殼體化。

ORF3編碼了一個含有123個氨基酸的小蛋白，最近有發現稱它是由一個雙順反子亞基因組翻譯而來。ORF3對于病毒顆粒的復制是非必需的，最新研究表明，該蛋白可能是一個離子通道蛋白。

HEV的防控是目前我國乃至世界的難題。HEV難于防控主要表現在以下幾方面：

(1)由于HEV在體外不能有效的感染細胞，因此缺少HEV體外細胞培養系；

(2)HEV缺少小動物模型；

(3)沒有特異性治療HEV的藥物；

(4)目前世界上沒有可以支持HEV持續復制的細胞系。