[發明專利]一種鳥苷酸環化酶催化合成環鳥苷二磷酸的方法

在審

• 申請號: 201910243224.8
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN110499323A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 黃衛東;郭嘉義;張燕;陳一帆;蘆曉紅;王銀
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/10;C12N9/88;C12P19/36
• 代理公司: 64104 銀川瑞海陳知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李杰<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明提供一種鳥苷酸環化酶催化合成環鳥苷二磷酸的方法，具體包括以下步驟：1)基因序列的獲??；2)突變重組載體的構建；3)酶切；4)轉化；5)誘導表達；6)破菌收集蛋白；7)蛋白純化；8)蛋白透析；9)采用BCA法測定蛋白濃度；10)蛋白體外催化反應。與現有技術相比，本發明利用一種新的基因?PA0847的編碼蛋白作為c?di?gmp催化酶；對野生型PA0847蛋白進行了點突變和基因工程改造；催化酶來源充足，純化方法穩定簡便；合成過程簡便，無污染；產物得率穩定，易于純化。

技術領域

本發明涉及一種鳥苷酸環化酶催化合成環鳥苷二磷酸的方法。

背景技術

據研究，c-di-GMP在細菌中廣泛存在并參與調控各種復雜的細胞活動(1)，如生物被膜形成(2)、毒力(3)、運動(4-5)，細胞分化(6)和感染過程中的免疫調節(7)等。

近年來，研究者對其感染過程的免疫調節作用進行了深入研究。2005年，EricB等人(8)發現c-di-GMP具有抗菌，抗病原體活性，并且治療效果存在劑量依賴性，表明c-di-GMP具有可觀的發展成為一種新型藥物的潛能，能夠單獨或者與其他藥物聯合使用，用于控制感染。2007年，KaraolisDKR等人(9)給小鼠和人未成熟網織紅細胞進行了外源性c-di-GMP抑制劑處理，并觀察了細胞激酶及各種化學物質的表達，通過ELISA、流式細胞術，實時定量PCR等檢測方法發現CD80/CD86以及成熟標志物CD83的表達增加，MHC家族2，白介素12,干擾素γ,白介素8,MCP-1,干擾素誘導蛋白10,以及RANTES,表明T淋巴細胞被活化，結論為c-di-GMP是一個免疫刺激劑。2007年，KaraolisDKR等人(10)通過動物實驗發現，c-di-GMP給藥可以激發宿主細胞的天然免疫作用，抵御外來細菌的感染，表現為中性白細胞和αβT細胞的增加，同時殺傷細胞活性增強。他們并且提出，c-di-GMP可以作為一種胞內免疫調節劑，免疫增強劑和疫苗輔助因子用于臨床上治療呼吸系統感染或者肺炎球菌感染。2008年，OgunniyiAD等人(11)發現c-di-GMP是一種可以提高保護性自身免疫而抑制其他多種細胞感染的分子。他們發現，c-di-GMP對處于生長中的肺炎鏈球菌并沒有短時作用；而通過建立小鼠模型，體內盡早使用c-di-GMP預防治療，卻可以減少細菌進入肺和血液，導致疾病的發生，提高了機體免疫系統對肺炎球菌的耐受能力。

2009年，McwhirterSM等人(12)通過分子水平研究發現，c-di-GMP對哺乳動物細胞的作用是經由一個新型免疫信號路徑完成。由c-di-GMP誘導產生的細胞溶質信號與核酸類似，誘導宿主細胞產生一系列作用，分泌包括一型干擾素在內的細胞因子，通過誘導TBK1，IRF3，NF-KB,H和MAP激酶的產生共同調節基因表達。與所有已知的核酸敏感通路不同的是，由于細菌一系列配體的產生，宿主細胞能夠誘導炎癥反應的發生。

2009年，研究人員(13)為c-di-GMP在胞內發揮功能提供了確切的證據，通過宿主化合物及免疫細胞構建出極強的感染模型，得出其功能信號通路，表明通過調控c-di-GMP的分泌可以影響A.phagocytophilum的感染毒力。

2011年，GabrielKristianP等人(14)成功制成了流感病毒H5N1疫苗：H5N1病毒體和細菌c-di-GMP聯合而成，進行了小鼠給藥實驗，并考察了舌下給藥、鼻內和肌肉內給藥三類方式的效果，發現三種方式均有效，證明了c-di-GMP與流感病毒致病體制成的疫苗對疾病有效。

2012年，Abdul-SaterA等人(15)的研究表明，c-di-GMP也可以使人體發生類似反應。通過逆轉錄PCR，紫外交聯等方法，證明c-di-GMP及其衍生物可激活人或鼠的多重炎癥反應，由此證明哺乳動物巨噬細胞對細菌c-di-GMP敏感，并能夠誘導產生大量炎癥反應。