[發(fā)明專(zhuān)利]一種幾丁質(zhì)酶CmChi6基因及其克隆表達(dá)與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910242877.4
• 申請(qǐng)日: 2019-03-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109810966B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳可泉;王瑩瑩;張阿磊;莫曉芳;周寧;楊賽;魏衍鵬;曹飛;歐陽(yáng)平凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/42
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)酶CmChi6基因及其克隆表達(dá)與應(yīng)用。本發(fā)明首次克隆出具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的外切幾丁質(zhì)酶CmChi6基因，并獲得了高活性外切幾丁質(zhì)酶，其制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品易保存，適宜的酶解溫度為45℃，酶解最適pH為7.4，在25?50℃時(shí)熱穩(wěn)定性良好，33 h仍保持60%以上酶活；最適pH 7.4，在pH7.0?10.0，33h酶活仍保持75％以上；Ba²⁺對(duì)CmChi6活力具有稍微的激活作用；CmChi6對(duì)膠體幾丁質(zhì)具有高降解活性，可用該酶制備幾丁二糖，轉(zhuǎn)化率高，能源消耗少，環(huán)境友好，在工業(yè)化降解幾丁質(zhì)應(yīng)用中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種幾丁質(zhì)酶CmChi6基因及其克隆表達(dá)與應(yīng)用。

背景技術(shù)

幾丁質(zhì)（Chitin）：又稱(chēng)甲殼素、甲殼質(zhì)、殼蛋白、殼多糖、明角質(zhì)等，是一種含氮的多糖物，是自然界第二大豐富的生物聚合物，分布十分廣泛，是許多低等動(dòng)物特別是節(jié)肢動(dòng)物如蝦、蟹、昆蟲(chóng)等外殼的重要成分，也是低等植物菌類(lèi)細(xì)胞膜的組成部分，地衣，綠藻、酵母、水母及烏賊體內(nèi)也含有。據(jù)估計(jì)每年的生物合成量超過(guò)100億噸，是一種巨大的可再生資源。

幾丁質(zhì)是由單體 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接起來(lái)的直鏈多聚體，分子量大多在 100 萬(wàn)以上。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物是高附加值的幾丁寡糖、幾丁單糖及相應(yīng)衍生物等，都具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗菌、降血壓和降低固醇及美容等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品等眾多領(lǐng)域。目前。幾丁質(zhì)制備幾丁寡糖主要為酸水解法。酸水解法常利用濃酸可將幾丁質(zhì)降解為氨基葡萄糖，經(jīng)乙酰化后獲得N-乙酰氨基葡萄糖；或利用稀酸降解幾丁質(zhì)獲得幾丁寡糖。但此方法工藝耗能大，產(chǎn)品得率低、產(chǎn)品生物活性差。尤其是污染嚴(yán)重問(wèn)題突出，因此工業(yè)生產(chǎn)急需一種綠色、環(huán)保、高效高產(chǎn)高品質(zhì)的降解幾丁質(zhì)方法。

幾丁質(zhì)酶（Chitinase， EC3.2.1.14）：是一種糖苷水解酶，細(xì)菌，真菌，植物及低等動(dòng)物均能產(chǎn)生。一般來(lái)說(shuō)它是一個(gè)酶系，包含多種同工酶。按切割糖苷鍵的方式的不同可分為外切幾丁質(zhì)酶，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。外切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)糖鏈非還原末端將幾丁質(zhì)降解為（GlcNAc）₂ ,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶與外切幾丁質(zhì)酶有所不同，其可隨機(jī)作用于幾丁質(zhì)長(zhǎng)鏈的任何一個(gè)糖苷鍵，并將其水解成幾丁寡糖；而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶不能作用于幾丁質(zhì)，只能水解幾丁寡糖為單糖GlcNAc。幾丁質(zhì)酶這種將幾丁質(zhì)降解為幾丁寡糖或單糖，反應(yīng)條件溫和，環(huán)保綠色，無(wú)污染物生成，且原料及成本投入較低的特性，可滿足工業(yè)化低成本和高產(chǎn)量的需要。因此，通過(guò)發(fā)掘具有極高價(jià)值的催化能力的幾丁質(zhì)酶對(duì)于降解幾丁質(zhì)資源具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種幾丁質(zhì)酶Cmchi6基因及其克隆表達(dá)與應(yīng)用。該基因來(lái)源于菌種Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1（ATCC BAA-2140^T），重組幾丁質(zhì)酶CmChi6酶活較高，可達(dá)1.00±0.05U。該酶的最適溫度45℃，在25-50℃時(shí)熱穩(wěn)定性良好，33 h仍保持60%以上酶活；最適pH 7.4，在pH7.0-10.0，33h 酶活仍保持75％以上，表明CmChi6穩(wěn)定性較高；Ba²⁺對(duì)CmChi6活力具有微弱的激活作用；CmChi6 水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物主要為（GlcNAc）₂，伴有少量GlcNAc；水解寡糖模式為典型的外切酶。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：