[發(fā)明專利]用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法

在審

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• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109777879A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張雪蓮;曹果清;張萬鋒;樂寶玉;張寧芳;成志敏;秦本源;高鵬飛;郭曉紅;蔡春波;李步高
• 申請（專利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明提供用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法。所述用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物序列如SEQ ID NO:1?2所示。本發(fā)明利用特異性引物將NR1H3基因的95bp缺失可變剪接體從該基因的多種剪接形式中分離出來，對NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確、快速、方便，具有很強的實用性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

肝X受體α(LXRα/NR1H3)是LXR核超受體家族的成員，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其活性受到膽固醇降解產(chǎn)物氧化型膽固醇的調(diào)節(jié)。NR1H3的生理功能主要是維持膽固醇水平、碳水化合物代謝、脂蛋白代謝和脂肪合成的穩(wěn)態(tài)。LXR具有調(diào)節(jié)組織脂質(zhì)生物合成的作用，LXRα影響動物的脂肪沉積和脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝，是肌肉中脂肪生成的正調(diào)節(jié)因子。豬NR1H3基因在組織中廣泛表達(dá)，但其多種可變剪接體的鑒別和分離進(jìn)展相對緩慢，這在一定程度上阻礙了NR1H3基因生理功能的研究。因此利用分子生物學(xué)手段鑒別某一剪接體組織表達(dá)模式，進(jìn)而對其生物學(xué)功能的闡明具有推動作用，意義重大。

從結(jié)構(gòu)上看，LXRs包含5個結(jié)構(gòu)域，即氨基端的配體非依賴性轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合域和羧基端的配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域與靶基因特異DNA結(jié)合，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控靶基因表達(dá)；鉸鏈區(qū)可保持受體蛋白的穩(wěn)定性，使受體在二聚化的同時與DNA結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)。

可變剪接體是影響蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要原因之一。在豬中僅發(fā)現(xiàn)一種NR1H3剪接異構(gòu)體，而且檢測繁瑣、耗時長、準(zhǔn)確率低，因此亟需開發(fā)新的檢測技術(shù)手段，為深入探究剪接體的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法。

發(fā)明人在對豬NR1H3基因克隆和功能研究的過程中發(fā)現(xiàn)長度為95bp的第9外顯子全部缺失，據(jù)此提供一種檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，可有效解決現(xiàn)有的檢測方法程序繁瑣、耗時長、準(zhǔn)確率低的問題。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供用于檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的引物，包括引物NX3-F和NX3-R，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1-2所示。

第二方面，本發(fā)明提供含有所述引物NX3-F和NX3-R的試劑盒。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括用于擴增18S內(nèi)參基因的引物18S-F和18S-R，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:3-4所示。

第三方面，本發(fā)明提供所述引物NX3-F和NX3-R、或含有上述引物的試劑盒在檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明提供一種檢測NR1H3基因95bp缺失可變剪接體的方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣本總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

2)以步驟1)的cDNA為模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR擴增18S內(nèi)參基因，同時利用引物NX3-F和NX3-R qPCR擴增NR1H3基因95bp缺失可變剪接體；

3)對步驟2)的qPCR實時監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行擴增曲線和熔解曲線分析，采用2^-△△CT相對定量方法計算NR1H3基因95bp缺失可變剪接體在不同組織中的表達(dá)量，用SPSS version20.0進(jìn)行差異顯著性檢驗并通過GraphPad Prism 5作圖。