[發(fā)明專利]一種在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)重組人源脯氨酰-4-羥化酶的方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910241421.6
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN110172470A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 項(xiàng)琪;黃亞東;肖巧學(xué);肖雪
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心;廣州市暨源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/02;C12P13/24;C12R1/84
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 吳小明

本發(fā)明公開了一種在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)重組人源脯氨酰?4?羥化酶(rhP4H)的方法，具體包括重組質(zhì)粒pPICZαA?P4Hα2和pHIL?PDI的構(gòu)建，P4Hα2和PDI共表達(dá)畢赤酵母工程菌GS115的轉(zhuǎn)化和陽性表達(dá)菌的篩選，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。所得到的rhP4H酶，無論是在酵母體系內(nèi)還是分離提純后均能特異性催化人源膠原蛋白結(jié)構(gòu)單元?Gly?X?Y?中脯氨酸的羥基化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程及酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)重組人源脯氨酰-4-羥化酶的方法及利用此酶催化人源膠原蛋白結(jié)構(gòu)單元-Gly-X-Y-中脯氨酸的羥基化形成羥脯氨酸的應(yīng)用。

背景技術(shù)

脯氨酰羥化酶(Prolyl 4-hydroxylase，P4H)是一種高度豐富的多功能酶，在蛋白翻譯后修飾中起關(guān)鍵作用，翻譯后修飾可改變蛋白構(gòu)象及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，并能夠進(jìn)一步進(jìn)行修飾。最有名的是在膠原合成中參與了前原膠原中脯氨酰殘基的羥基化，對新合成的前膠原鏈形成正確折疊，保持三螺旋結(jié)構(gòu)具有重要意義。在人類和其他脊椎動物中，脯氨酰羥化酶是一個α2β2異源四聚體，由兩個α亞基(P4Hα1和P4Hα2)和兩個β亞基(PDI)組成，在膠原生物合成中，通過將新合成的前膠原結(jié)構(gòu)中(-Gly-X-Y-)的脯氨酸羥化成羥脯氨酸，來保證新合成的膠原蛋白形成正確的三維折疊，從而使膠原蛋白發(fā)揮正常的生理功能。α亞基(P4Hα)具有幾種不同的類型，提供酶活性催化位點(diǎn)的主要部分。β亞基(PDI)是含有兩個硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的二硫鍵異構(gòu)酶，其催化二硫鍵的形成、還原和異構(gòu)化，進(jìn)而輔助蛋白的折疊和復(fù)性，從而能更好的促進(jìn)P4Hα活性的揮發(fā)。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)rhP4H中α和β在1:1時或者大于1:1時才具有催化Pro轉(zhuǎn)化為HYP的活性(Vuorela A,Myllyharju J,Nissi R,et al.EmboJournal,2014,16(22):6702-6712.；Buechter D D,Paolella D N,Leslie B S,etal.Journal of Biological Chemistry,2003,278(1):645-650.)。在植物和病毒中也存在脯氨酰羥化酶，然而植物的脯氨酰羥化酶主要以多聚的L-脯氨酸或者類似的序列為底物，而非類似人膠原中的Gly-X-Y重復(fù)單元，特異性不好。

Stein Hanan等在煙草中表達(dá)了重組人脯氨酰-4-羥化酶(Biomacromolecules,2009,10:2640-5.)，占鵬飛等以家蠶為生物工廠共表達(dá)了Ⅰ型類人膠原蛋白和脯氨酰4-羥化酶α-蛋白的品系構(gòu)建(蠶業(yè)科學(xué),2016(5):832-839.)，對于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，PinkasDaniel M在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了rhP4H翻譯后再修飾(ACS Chem.Biol.,2011,6:320-4)。中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)?7195401.5)涉及了人脯氨酰-4-羥化酶α亞單位同工型，編碼這些新蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，和制備這些蛋白質(zhì)的方法。更多的中國發(fā)明專利申請是針對植物中的脯氨酸羥化酶的發(fā)明，不是人源脯氨酰羥化酶。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明對人源的P4H酶進(jìn)行體外重組表達(dá)，采用巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，具有有無致熱源、可進(jìn)行翻譯后加工修飾、且外源基因遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。

因此，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)：

1.一種在畢赤酵母中表達(dá)重組人源脯氨酰-4-羥化酶(rhP4H)的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建分別表達(dá)所述脯氨酰-4-羥化酶的α亞基(P4Hα2)和β亞基(PDI)的重組表達(dá)質(zhì)粒，并將其共同導(dǎo)入畢赤酵母菌株中；和

(2)通過抗生素抗性篩選和誘導(dǎo)培養(yǎng)，從畢赤酵母細(xì)胞中和/或培養(yǎng)物上清中獲得所述重組人源脯氨酰-4-羥化酶。