[發明專利]一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法

在審

• 申請號: 201910238608.0
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109837320A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 劉瑞艷;馬杰希;劉偉;張彩霞;寇鳳雨
• 申請（專利權）人: 山東泓達生物科技有限公司;山東昆達生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/42
• 分類號: C12P19/42;C12N1/20;C12R1/38
• 代理公司: 青島高曉專利事務所(普通合伙) 37104
• 代理人: 吳冬群

本發明涉及生物發酵技術領域，尤其是一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法。本發明的一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法，通過經大量實驗優化的母瓶培養基、搖瓶培養基和補料培養基，在最優發酵條件下培養維生素B12的生產菌株；發酵過程前期的0?39h內控制溫度在一個相對較低的水平，即26?30℃，從而控制菌種處于合適的生長速率和保持良好的菌形；在發酵過程中后期提高并維持發酵體系溫度在一個的相對較高的水平，即30?34℃，以促進菌體生長、維生素B12合成的啟動和積累，進而使發酵結束后，維生素B12發酵單位高達198mg/L，不僅提高了維生素B12的產量和生產效率，而且節約能耗、降低成本。

技術領域

本發明涉及生物發酵技術領域，尤其是一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法。

背景技術

維生素B12（Vitamin B12）又稱鈷胺素，是一類含有鈷的咕啉類化合物總稱，最早作為“抗惡性貧血因子”于1926年被發現。維生素B12是一種重要的生物活性物質，同時也是許多微生物和動物的生長因子，廣泛應用于醫藥、食品和畜牧業。由于維生素B12的分子結構極為復雜，其全化學合成需要多達70余個的反應步驟，且成本昂貴，故目前幾乎都是通過微生物發酵的方式來生產維生素B12。自然界中，維生素B12的生物合成存在兩種不同的途徑，即好氧途徑和厭氧途徑，但是VB12的生物合成嚴格局限于一些微生物中，目前成功應用于工業化發酵的生產菌株主要有費氏丙酸桿菌（Propiomibacterium freudenreichii）、謝氏丙酸桿菌（Propiomibacterium shermanii）和脫氮假單胞桿菌（Pseudomonasdenitrificans）。其中，因脫氮假單胞桿菌好氧合成維生素B12的途徑清晰明了且維生素B12產率高，因而，目前工業生產幾乎都是使用脫氮假單胞桿菌來作為生產維生素B12的工業菌株。

脫氮假單胞桿菌好氧發酵生產維生素B12的過程控制條件比較嚴格，一旦控制不好就會導致菌體發虛早衰進而影響維生素B12的產量。因此，發酵過程中維持脫氮假單胞桿菌的菌體形態至關重要。除了發酵培養基、pH和轉速等能夠影響菌體形態之外，溫度也是影響菌種菌形的關鍵因素。對同一微生物來說，不同的生理生化過程有著不同的最適溫度，也就是說，菌體生長量最高時的培養溫度不等于發酵速率最高時的培養溫度或累積代謝產物量最高時的培養溫度。因此，對微生物發酵過程中調整溫度以達到發酵前期利于菌體生長，中后期利于次級代謝產物積累的目的，進而促進維生素B12產量。

由于維生素B12應用領域越來越廣，目前，維生素B12需求量較大，因此本領域迫切需要開發高效的生產維生素B12的方法，不僅要提高維生素B12的產量，而且盡可能的節約能耗、降低成本，提高生產效率，以滿足市場的需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法，提高維生素B12的產量，節約能耗、降低成本，提高生產效率。

本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：

一種提高脫氮假單胞桿菌產維生素B12的方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、母瓶培養過程控制：將活化的脫氮假單胞桿菌二代斜面刮取適量菌體接種于母瓶培養基中，溫度控制在27 - 29℃，濕度控制在30 - 60%，培養時間為18 - 24h小時；

S2、搖瓶培養過程控制：將符合標準的脫氮假單胞桿菌母瓶培養基在無菌條件下接入搖瓶培養基，接種量為10%，發酵前期（0-39h）搖床溫度控制在26-30℃；發酵中后期（39-170h）搖床溫度控制在30-34℃，濕度控制在30 - 60%；培養時間為170h；

S3、補料控制：步驟S2的發酵過程中，分別于第3d、4d、5d時檢測總糖含量，當總糖含量低于5%進行補料，維持發酵液總糖含量控制在5-7%，至發酵結束，從發酵液中分離純化出維生素B12。