[發明專利]基于數字PCR技術檢測EGFR基因L858R突變的特異性引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201910234672.1
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN110066873A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 許寶芝;秦穎
• 申請（專利權）人: 德路通（石家莊）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 石家莊旭昌知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 13126
• 代理人: 雷瑩

1.一種基于數字PCR技術檢測EGFR基因L858R突變的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：

所述上游引物，選自以下核苷酸序列的一種：

5′-ACT ACTTGGAGGA CCGTCGCTT-3′，

5′-ACTTGGAGGA CCGTCGCTTG-3′，

5′-CCAGGAACGTA CTGGTGAAAA C-3′或

5′-CAGGAACGTA CTGGTGAAAA CA-3′；

所述下游引物，選自以下核苷酸序列的一種：

5′-ATGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC-3′，

5′-CTTTCTCTTCCGCACCCAGC-3′或

5′-GTATTCTTTCTCTTCCGCACCC-3′。

2.一種基于數字PCR技術檢測EGFR基因L858R突變的探針，用于與權利要求1中所述的特異性引物配合使用，其特征在于：包括突變型探針和野生型探針；

所述突變型探針的核苷酸序列為5′-FAM-TTGGGCGGGCCAA ACT-MGB-NFQ-3′；所述突變型探針5′端設有熒光基團FAM，所述突變型探針3′端設有淬滅基團NFQ；

所述野生型探針的核苷酸序列為5′-VIC-TTGGGCTGGCCAA ACT-MGB-NFQ-3′；所述野生型探針5′端設有熒光基團VIC，所述野生型探針3′端設有淬滅基團NFQ。

3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于：所述突變型探針和所述野生型探針均加入MGB。

4.一種基于數字PCR技術檢測EGFR基因L858R突變的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的特異性引物和權利要求2-3中任一項所述的探針。

5.根據權利要求4所述的的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括PCR預混液，所述預混液包括dNTPs、Taq酶和PCR緩沖液。

6.根據權利要求4或5中任一項所述的的試劑盒，其特征在于：所述上游引物于PCR反應擴增體系中的終濃度為400～500nM，所述下游引物于所述PCR反應擴增體系中的終濃度為400～500nM，所述突變型探針于所述PCR反應擴增體系中的終濃度為200～300nM，所述野生型探針于所述PCR反應擴增體系中的終濃度為200～300nM。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述PCR反應擴增體系的擴增條件為：

a、95℃10min，進行1個循環；

b、94℃30s，58℃1min，進行40個循環；

c、98℃10min，進行1個循環；

d、4℃維持。

8.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于：所述DNA模板的來源為病理組織中提取的DNA、病理切片中提取的DNA或血漿游離DNA。