[發(fā)明專利]用于檢測PCV1和PCV3的實時熒光定量PCR-HRM引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910222079.5
• 申請日: 2019-03-22
• 公開（公告）號: CN109735665A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳如敬;陳秋勇;吳學(xué)敏;車勇良;王晨燕;周倫江;侯博;嚴山;王隆柏;魏宏
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明涉及一組用于檢測豬圓環(huán)病毒1型和豬圓環(huán)病毒3型的實時熒光定量PCR?HRM引物，屬于動物傳染病學(xué)領(lǐng)域。該引物根據(jù)PCV1和PCV3基因組在復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）的核苷酸序列特征性差異設(shè)計，該差異區(qū)PCV1和PCV3存在明顯的特征性核苷酸序列差異（GC%含量存在差異），導(dǎo)致PCV1和PCV3在該區(qū)域存在熔解溫度（Tm）峰值差異，經(jīng)過建立的實時熒光定量PCR方法擴增后，會出現(xiàn)不同的Tm峰值進行PCV1和PCV3的區(qū)分。本發(fā)明僅需一組引物即可對PCV1和PCV3進行鑒別診斷，同時還可特異性的明確豬只感染PCV1和PCV3的感染程度。本發(fā)明使用方法簡單有效，成本低廉，準(zhǔn)確性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一組用于檢測豬圓環(huán)病毒1型和豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirustype 1 and type 3，PCV1和PCV3)的實時熒光定量PCR-HRM引物，屬于動物傳染病學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

高分辨率熔解曲線（High Resolution Melt，HRM ）是一種簡單、快速、低成本的PCR擴增后檢測技術(shù)，可用于高通量的突變掃描和基因分型。該技術(shù)僅僅只是在標(biāo)準(zhǔn)PCR試劑的基礎(chǔ)上再加入雙鏈DNA結(jié)合染料即可進行，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨率熔解曲線，即可完成對樣品基因型的分析。當(dāng)使用SYBR Green I 為熒光染料時，在實時熒光PCR擴增結(jié)束后通常要運行一步熔解曲線反應(yīng)程序。即將PCR產(chǎn)物的溫度由低到高逐步升高，在升溫的過程中，雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA分子，原先與雙鏈結(jié)合的熒光染料分子就與DNA脫離，而不再產(chǎn)生熒光信號。因此，隨著溫度的升高，樣品的熒光信號由強轉(zhuǎn)弱，從而形成一個熒光信號隨溫度升高而減弱的熔解曲線圖，再以熒光值隨溫度的變化率為縱坐標(biāo)作圖，就形成熒光變化率隨溫度變化的峰形圖，每一個樣品在該圖上呈現(xiàn)為一個峰形曲線。這個峰值所對應(yīng)的特定溫度我們就稱之為該樣品的熔解溫度Tm，在該溫度下50%的雙鏈已解鏈變?yōu)閱捂湥摐囟群蛿U增區(qū)域的GC%含量存明顯的正相關(guān)關(guān)系。

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus, PCV）是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒之一，當(dāng)前豬圓環(huán)病毒有3種：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1為非致病性的病毒；PCV2為致病性的病毒；PCV3的有無致病力好需要更進一步深入明確。對PCV1和PCV2的基因組進行分析發(fā)現(xiàn)，PCV1基因組全長1759bp，PCV2全長1768 bp（或1767 bp），二者序列同源性小于80%，但PCV-1毒株間的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株間的核序列同源性大于96%。ORF1是PCV1和PCV2最大的閱讀框，位于病毒基因組的5’端，編碼病毒的復(fù)制蛋白（Rep），分子量大小為37KDa，與病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

2016年，美國堪薩斯州立大學(xué)科研人員利用宏基因組測序技術(shù)，從患有皮炎腎病綜合征（PDNS）和繁殖障礙母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出一種新型豬圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。作為一種新發(fā)現(xiàn)病原體，PCV3對豬致病性及在豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）中作用以及現(xiàn)有商品化PCV2疫苗對其免疫效力等有待進一步研究。和PCV1、PCV2一樣，PCV3病毒顆粒直徑為17-20nm，核酸類型為單股DNA病毒，基因組長度為2000bp，包含有與復(fù)制相關(guān)的復(fù)制蛋白rep和與抗原相關(guān)的抗原蛋白cap。

本發(fā)明的目的是提供一種PCV1和PCV3的鑒別診斷方法。一般而言，對2種或以上的病原進行實時熒光定量PCR需要分別設(shè)計引物，進行分別擴增，再組裝成多重試劑盒。即一般需要設(shè)計4條引物，才可以對豬圓環(huán)病毒2種基因型（PCV1和PCV3）進行擴增。但是4條引物在條件優(yōu)化上均為繁瑣復(fù)雜，且引物越多可能導(dǎo)致的潛在交叉可能性越大，較難達到相關(guān)研究目的。本發(fā)明最大的優(yōu)點是基于PCV1和PCV3的基因組結(jié)構(gòu)特點，選擇PCV1和PCV3的復(fù)制相關(guān)蛋白編碼區(qū)核苷酸特異性差異區(qū)設(shè)計引物（一組引物），該引物針對的區(qū)域需要同時對PCV1和PCV3均可進行實時熒光定量PCR，且該擴增區(qū)域存在核苷酸特征的GC含量差異，導(dǎo)致實時熒光定量結(jié)果的溶解曲線Tm值存在差異，即可對PCV1和PCV3進行鑒別診斷。本發(fā)明的建立可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。