[發(fā)明專利]靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物的合成及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910219785.4
• 申請日: 2019-03-22
• 公開（公告）號: CN109942688B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉寬燦;謝富安;趙婷婷;張蕊;肖章武;林寶順;高安定;王軍凱
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/04;C07K1/06;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明公開了靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物的合成及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過化學(xué)合成，獲得了靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物；將靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物Peptide 42加入食管鱗癌細胞KYSE450的細胞培養(yǎng)基中，通過細胞增殖實驗、劃痕、細胞侵襲以及成瘤實驗鑒定該多肽藥物的功能表明該多肽藥物使細胞增殖速率降低，細胞遷移能力、侵襲能力下降，成瘤能力差，具有顯著的腫瘤抑制功能，具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物的合成及應(yīng)用。

背景技術(shù)

前期，我們通過建立了高通量的肽適配子文庫和篩選方法（具體應(yīng)用請見專利ZL201410339641.X），并篩選獲得了幾個與Sox2蛋白緊密結(jié)合的肽適配子（具體應(yīng)用請見專利ZL201510263530.X），同時驗證了它們的功能，在此基礎(chǔ)上，我們對P42肽適配子進行化學(xué)合成和修飾。

Sox2蛋白是一個強大的轉(zhuǎn)錄因子，在多個腫瘤的惡性進程（如腫瘤發(fā)生、腫瘤細胞增殖，侵襲轉(zhuǎn)移，腫瘤干細胞特性維持、化療藥物抗性等）的多個方面起重要作用。

腫瘤細胞增殖實驗主要包括細胞計數(shù)和克隆形成實驗，細胞計數(shù)實驗可以通過直接計數(shù)以及其他檢測方法如CCK8等方法完成。劃痕實驗是通過在培養(yǎng)的細胞中進行劃痕來檢測細胞的遷移能力，它反映腫瘤細胞的運動能力。

腫瘤細胞侵襲實驗是一個模擬體內(nèi)環(huán)境，依賴腫瘤細胞分泌蛋白酶降解基質(zhì)，從而使細胞具備轉(zhuǎn)移能力的能力測試，它從一定程度反映了細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。而成瘤實驗可在小鼠體內(nèi)真實反映處理后的細胞腫瘤再生能力，常用于藥物的篩選。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一個具有特定空間構(gòu)象并能特異靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物的合成及應(yīng)用。通過細胞增殖實驗、劃痕、細胞侵襲以及成瘤實驗對該多臺藥物的功能鑒定，表明該多肽藥物使細胞增殖速率降低，細胞遷移能力、侵襲能力下降，成瘤能力差，具有顯著的腫瘤抑制功能，具有重要的應(yīng)用價值。

靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物，其序列為：TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPVWFSTLFFPLFFLISLARGPC。該序列包含特異靶向結(jié)合Sox2蛋白的肽適配子FSTLFFPLFFL，同時在其氨基端添加了紅色熒光標(biāo)記基團TAMRA和穿透肽序列YGRKKRRQRRR。

上述靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物經(jīng)化學(xué)合成，并讓其中的2個半胱氨酸形成一個二硫鍵，以此形成具有特定結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。同時化學(xué)合成沒有特異靶向結(jié)合Sox2蛋白的肽適配子FSTLFFPLFFL的TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPV

WISLARGPC作為對照。

上述靶向結(jié)合Sox2的多肽藥物的化學(xué)合成方法為：以Fmoc-AA樹脂為原料，以HOBT為活化劑，DIC為縮合劑，Collidine為堿試劑合成帶保護的肽樹脂；再經(jīng)切割液切割得肽粗品；肽粗品經(jīng)空氣氧化法氧化獲得精品多肽藥物。其中Fmoc-AA：DIC：HOBT：collidine的體積比為1:1:1:2, Fmoc-AA縮合過程用量過量2.5倍，每一步縮合都經(jīng)過凱撒試劑（Kaisertest）檢測，如顏色呈陽性則重復(fù)縮合氨基酸；切割液為：三氟醋酸：EDT：水：對甲酚的體積比為87.5：5：2.5：5；空氣氧化法為：肽粗品溶于純水，用氨水調(diào)pH值到9，室溫攪拌反應(yīng)24小時。

上述靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物功能的鑒定，包括以下步驟：

1）腫瘤細胞增殖實驗：在接種同樣量細胞的食管鱗癌細胞KYSE450細胞培養(yǎng)基中添加靶向結(jié)合Sox2蛋白的多肽藥物和對照，并在一天后，往細胞培養(yǎng)基中加入CCK8，在第三天、第五天、第七天測定每個孔的吸光值OD₄₅₀和OD₆₅₀ ，以此反映細胞的增殖情況并統(tǒng)計分析；