[發明專利]利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和LGOX產戊二酸的方法

在審

• 申請號: 201910206980.3
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN109868297A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 陳可泉;蘇芮;王昕;許晟;馮嬌;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12N15/70;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，構建重組菌株E.coli BL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX；步驟2，選取重組菌株E.coli BL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX分別用pH7.0的 PBS重懸并濃縮后，按照比例加入催化體系中，再加入底物L-賴氨酸和L-谷氨酸鈉催化反應生成戊二酸。

2.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟1，將片段davA和davB與表達載體pET-22b相連，得到重組質粒pET22b–DavBA，將重組質粒pET22b-DavBA導入E.coliBL21的感受態細胞中，從平板上挑取重組菌株E.coli BL-22AB的單菌落接種到含有100mg/L氨芐青霉素抗性的5mlLB搖管中，培養6-8h后轉接到含有100mg/L氨芐青霉素抗性的100mlLB培養基里，培養至OD₆₀₀=0.3，離心收菌，得到過表達了davBA的重組菌E.coliBL-22AB；將片段gabD 和gabT與表達載體pACYC相連，得到重組質粒pACYC-gabTD；將片段LGOX與表達載體pET-28a相連，得到重組質粒pET-28LGOX；將重組質粒pACYC-gabTD與重組質粒pET-28LGOX共同導入E.coli BL21（DE3）中，從平板上挑取重組菌株E.coli-YDT-28LGOX的單菌落接種到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB搖管中，培養6-8h后轉接到含有和35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100mlLB培養基中，培養至OD₆₀₀=0.8，離心收菌，得到過表達了gabDT和LGOX的重組菌株E.coliBL-YDT-28LGOX。

3.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟2中催化體系中底物L-賴氨酸和L-谷氨酸鈉摩爾比為1：3。

4.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟2中催化反應中誘導溫度為25℃。

5.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟2中催化反應中所述的IPTG添加量為1.0mmol/L。

6.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟2中催化反應中E.coli BL-22AB細胞和E.coli BL-YDT-28LGOX細胞OD比例為1：4。

7.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX產戊二酸的方法，其特征在于，步驟2中將重組菌株E.coli BL-22AB細胞和重組菌株E.coli BL-YDT-28LGOX細胞比例按照1:1混合，加入10g/L底物L-賴氨酸和10g/L底物L-谷氨酸鈉，在37℃，轉速200rpm條件下進行催化反應，定時取樣，所述E.coli BL-22AB OD₆₀₀=5。