[發明專利]一種斯氏普羅威登斯菌固定化酶的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201910204715.1
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109750027A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 吳小毛;張承;李榮玉;龍友華;李姣紅;王秋萍;黃文源;代園鳳
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10;C12N11/04;B09C1/10;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/38
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李余江;程新敏

本發明公開了一種斯氏普羅威登斯菌固定化酶的制備方法及應用，其以斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)CCTCC M 2017738為菌種，以海藻酸鈉為固定化材料，將經菌懸液擴繁和降解酶劑超聲破碎提取制備斯氏普羅威登斯菌酶液有效地包埋而制成固定化酶。該固定化酶可應用于高效降解土壤和水體中的菌核凈、烯菌酮和異菌脲。具有持效性好、環境友好、效果顯著、成本低廉和易于推廣等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術降解農藥殘留領域，特別是一種斯氏普羅威登斯菌固定化酶的制備方法及應用。

背景技術

農藥在農業病蟲害綜合治理中發揮著重要作用，但農藥殘留及其代謝產物已成為嚴重污染物，對人類健康和生態系統構成威脅。菌核凈(Dimetachlone)，又稱紋枯利，分子式C₁₀H₇Cl₂NO₂，其相對分子質量244.07，化學名為：N-(3,5-二氯苯基)丁二酰亞胺。在我國廣泛用于油菜、大白菜、紫菜苔、生菜、韭菜、黃瓜、番茄、辣椒、馬鈴薯、煙草等作物上菌核病、紋枯病、赤星病等真菌病害的防治。盡管菌核凈的殺菌活力前景看好，但由于健康問題，目前在美國和歐洲被禁止使用，但在一些發展中國家仍然廣泛使用(如中國)。此外，以往的研究表明0.4mmol/L的菌核凈是大鼠急性腎毒性物質，且其對哺乳動物內分泌具有干擾作用，對人體腎臟也有毒害作用。綜上所述，農業中菌核凈的大量使用會產生菌核凈的暴露，這對人體健康和環境安全構成潛在威脅，消除菌核凈污染物的生態友好和低成本策略迫切需要建立。

在許多國家，包括立法、農業標準化、農民教育和修復技術等多種措施來解決菌核凈殘留問題，雖然這些措施有助于去除農藥殘留，但菌核凈均不能有效地去除。生物修復(Bioremediation)是一種利用活體微生物或來自微生物的酶對污染物進行解毒和降解，其具有操作簡便、經濟實用、環境友好等諸多優點的環境和經濟有效的方法。然而，游離細胞和酶容易受到多種環境因素(如溫度、酸堿度等)的影響，且其不穩定性、生產成本高和分離困難，這在很大程度上限制了實際應用。幸運的是，固定化技術提供了解決這些挑戰的替代方案，并且已經成為提高微生物及酶穩定性、可操作性、耐久性和商業可行性的完美選擇。迄今為止，尚無研究工作開展菌核凈的生物降解。

發明內容

本發明針對菌核凈降解技術缺乏，旨在提供一種高效降解菌核凈的持效性好、環境友好、效果顯著和成本低廉的斯氏普羅威登斯菌固定化酶制備方法及其應用。

本發明的技術方案如下：

該斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)菌株的保藏編號為CCTCCM2017738，為現有菌株。本發明的技術方案是以斯氏普羅威登斯菌Providencia stuartii為菌種，以海藻酸鈉和竹炭為固定化材料，將斯氏普羅威登斯菌有效地包埋而制成固定化酶。

其中，所述斯氏普羅威登斯菌固定化酶制備包括如下步驟：

1)菌懸液制備：無菌條件下加入2mL無菌磷酸鹽緩沖液于培養48h的菌種培養皿中平行振蕩，并用接種環輕輕刮落培養基表面的菌落，即成粗制菌懸液，將其轉移到液體發酵培養基(牛肉膏8g/L、酵母膏14g/L、NaCl 5g/L)中在pH為7～8，35℃，150～200rpm條件下培養48h。將取出的發酵液立即在8000～10000r/min，3～4℃下離心10～15min，收集濕菌體，并用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次。然后將無菌磷酸鹽緩沖液與濕菌體混勻，控制菌體數量為≥6×10¹⁰cfu/mL。制得的菌懸液3～4℃保存備用。

2)游離酶提取：對步驟1)制得的菌懸液進行超聲破碎提取游離酶，超聲破碎時間10～15min，功率320W，每10s一個周期(工作5s，間歇5s)。破碎液在8000～10000r/min，3～4℃下離心10～15min，得上清液即制得游離酶。上清液游離酶含量控制在大于等于2.80mg/mL。