[發(fā)明專利]定量檢測硫酸鹽還原菌的方法及專用引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910203424.0
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109762916A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張世侖;王大威;靖波;張健;王秀軍;景宏;馬挺
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋石油集團(tuán)有限公司;中海油研究總院有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

1.一種定量檢測待測樣品中硫酸鹽還原菌含量的方法，包括如下步驟：

1)、提取待測樣品中細(xì)菌的基因組DNA和獲得不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

所述獲得不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法包括如下步驟：

1)-a、制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將含有異化型亞硫酸鹽還原酶基因的質(zhì)粒溶于水中，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

1)-b、檢測所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)：

先檢測所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD₂₆₀值，再按照如下公式1至公式3計算標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)：

標(biāo)準(zhǔn)品的濃度A(ng/μL)＝標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD₂₆₀值×50(ng/μL) (公式1)；

標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾質(zhì)量B(g)＝標(biāo)準(zhǔn)品堿基數(shù)的對數(shù)×660(g) (公式2)；

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)(copies/μL)＝6.02×10²³×標(biāo)準(zhǔn)品的濃度A×10^-9(g/μL)/標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾質(zhì)量B (公式3)；

1)-c、按照所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，得到稀釋后不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

2)、用成套引物分別對所述稀釋后不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品中細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)和待測樣品的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)；

再以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

再將所述待測樣品的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得待測樣品中異化型亞硫酸鹽還原酶基因拷貝數(shù)，即為待測樣品中硫酸鹽還原菌含量；

所述成套引物，為能擴(kuò)增靶序列的引物對；

所述靶序列為由引物F和引物R擴(kuò)增得到的片段；

所述引物F為如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的單鏈DNA分子；

a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的單鏈DNA分子；

所述引物R為如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的單鏈DNA分子；

b2)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的單鏈DNA分子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述異化型亞硫酸鹽還原酶基因為如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列3所示的單鏈DNA分子；

c2)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的單鏈DNA分子。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述按照所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行10倍梯度稀釋至10²copies/μL，得到稀釋后不同質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

4.權(quán)利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和記載所述公式1至公式3)的可讀載體在定量檢測待測樣本硫酸鹽還原菌含量中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和記載所述公式1至公式3)的可讀載體在制備定量檢測待測樣本硫酸鹽還原菌含量產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6.一種定量檢測待測樣本硫酸鹽還原菌含量產(chǎn)品，包括權(quán)利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和記載所述公式1至公式3)的可讀載體。