[發(fā)明專利]一種無痕化雙靶點基因組編輯系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910201916.6
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109825522B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設計）人: 鄭繼平;郭桂英;曾紀鋒;楊諾;周楚新;李遷
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開一種基于CRISPR/Cas9和λ?Red的無痕化雙靶點基因組編輯系統(tǒng)，其特征在于：1.pKS9分子量11,681kb，為溫敏性質(zhì)粒。含有基因：受四環(huán)素誘導的cas9和recX基因；受阿拉伯糖誘導的λ?Red完整αβγ重組酶基因；抗性基因amp^r。2.pCSK分子量2,914 kb，含有兩個用于特異性識別基因組的sgRNA插入位點；兩個受鼠李糖誘導、用于自身質(zhì)粒消除的間隔區(qū)gRNA序列；抗性基因kan^r。3.在同源臂27bp時，同時雙點突變效率皆在92%以上；在同源臂40bp時，同時雙基因的1kb替換效率在60%以上，當大片段基因替換和點突變同時進行時，各自的編輯效率不受影響。

技術領域

本發(fā)明屬于基因組編輯技術領域，具體涉及一種基于細菌CRISPR/Cas9 II型免疫系統(tǒng)和λ-Red DNA重組系統(tǒng)相結(jié)合的高效、無痕化基因組編輯方法。

背景技術

CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats），可直譯為成簇的、有規(guī)律的間隔短回文重復序列，是一種廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的高效基因剪切器，用于抵御外來遺傳物質(zhì)如噬菌體的侵入。在結(jié)構(gòu)上，該系統(tǒng)由一個前導區(qū)(Leader)、多個高度保守的短重復序列區(qū)(Repeat)和存在于重復序列區(qū)間的多個間隔區(qū)(Spacer)所組成。前導區(qū)富含AT，長度為300～500bp的區(qū)域，一般位于CRISPR上游，被認為是CRISPR的啟動子序列。重復序列區(qū)長度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。間隔區(qū)長度為26～72bp，由俘獲的外源DNA組成，其功能類似于免疫記憶，即用于細菌對含有該序列的外源DNA再次入侵時的識別，并通過Cas（CRISPR-associated）蛋白對其進行雙鏈剪切。基于Cas蛋白基因序列的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為多種，但只有Ⅱ型CRISPR/Cas9最為簡單而被廣泛應用。其作用原理是：在前導區(qū)的調(diào)控下，CRISPR區(qū)首先轉(zhuǎn)錄為長的pre-crRNA (Pre RISPR RNA)，并逐步加工為含有保守重復序列和間隔區(qū)的一系列成熟crRNA，同時進行轉(zhuǎn)錄的還有與crRNA重復序列互補的tracrRNA (Trans-activating crRNA)。當crRNA與tracrRNA轉(zhuǎn)錄出來后，二者互補配對而形成復合物，通過間隔區(qū)特異性識別靶基因序列，引導Cas9核酸內(nèi)切酶在靶向位點進行雙鏈DNA剪切。由于在細菌中幾乎不存在非同源重組的修復功能，因此，該雙鏈斷裂將導致外源DNA的降解，從而達到對噬菌體等可識別入侵DNA的有效抵御。但如果此時存在有外源供體DNA片段（Donor）時，由于細菌具有同源重組修復機制而引發(fā)外源供體DNA片段與被剪切基因組之間發(fā)生同源重組，從而實現(xiàn)對基因組DNA的編輯。可見，CRISPR/Cas并沒有基因重組活性，其功能只是造成基因組的雙鏈斷裂，因此更適合于基因重組工程中的選擇壓力或者反向篩選，即只有發(fā)生重組的陽性突變子才能保留。