[發明專利]ATP生物熒光lgCA-lgIA標曲法檢測鍍膜抗菌玻璃抗真菌性能的方法

在審

• 申請號: 201910199732.0
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN110272955A
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 李文杰;張進杰;溫昊松;鐘亞莉;楊志偉
• 申請（專利權）人: 秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/06;C12N1/16;C12N1/14;C12R1/725;C12R1/685;C12R1/82;C12R1/645
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1.一種鍍膜抗菌玻璃抗真菌性能的檢測方法，包括：(1)樣品制備及前處理；(2)設備選型及試劑、培養基配制；(3)菌種保藏、活化及菌懸液制備；(4)美藍染色后菌懸液活菌含量C_B的血球板計數；(5)ATP濃度對數值lgC_A-相對熒光強度對數值lgI_A標準曲線建立及接種菌液的活菌ATP濃度C_A標定；(6)樣品接種、培養及洗脫回收；(7)回收液相對熒光強度值I_A測定；(8)回收液活菌ATP濃度C_A和T_A推算及抗菌率R和抗菌活性值A計算；(9)結果評價；其特征在于，應用ATP熒光光度計對以抗菌率R或抗菌活性值A表征的鍍膜抗菌玻璃抗真菌性能進行精準定量測試的ATP生物熒光lgC_A-lgI_A標準曲線法，具體的：

在回收液相對熒光強度值I_A測定中：

明確對照樣品和抗菌樣品的數量、尺寸及前處理要求，將真菌試驗菌種的標準菌株進行傳代、活化后，取新鮮白色念珠菌或霉菌孢子培養物制備菌懸液；經美藍染色后用血球計數板測定菌液中活菌含量C_B，并對不同稀釋度的菌懸液進行C_B標定，然后，用ATP熒光試劑緩沖溶液將1.0×10^-3mol/L的ATP標準原液稀釋為高、低濃度標準系列溶液：7.0×10^-8mol/L、7.0×10^-7mol/L、7.0×10^-6mol/L和2.1×10^-9mol/L、2.1×10^-8mol/L、2.1×10^-7mol/L，測定其相對熒光強度值I_A；繪制兩條相應濃度的lgC_A-lgI_A標準曲線，推導得出曲線方程式Y＝a_A0X+b_A0(高濃度)、Y＝a_AX+b_A(低濃度)和線性相關系數R_A0²(高濃度)、R_A²(低濃度)，同時，用察氏培養液對活菌含量C_B為1.0×10⁸CFU/mL～5.0×10⁸CFU/mL的試驗菌種懸浮液進行連續10倍梯度稀釋，測定稀釋菌液的相對熒光強度值I_A，根據高濃度標準曲線方程式Y＝a_A0X+b_A0推算其相應的活菌ATP濃度C_A；經調整得到C_A為5.0×10^-7mol/L～9.0×10^-7mol/L的接種菌液，向各組樣品待測表面分別滴加0.3mL接種菌液，采用4.6mL洗脫液立即對6組0h接觸樣品進行洗脫回收，測定回收液的相對熒光強度值I_AC0ij、I_AT0ij，并根據低濃度標準曲線方程式Y＝a_AX+b_A推算其活菌ATP濃度C_AOij和T_AOij，同時，在95％RH±2％RH的濕度條件下，將6組密封于無菌平皿內的對照樣品及抗菌樣品在(30±2)℃(白色念珠菌)培養24h±2h或(28±2)℃(霉菌)培養48h±2h后；采用與0h接觸樣品相同的方式洗脫回收表面殘留菌并測定其回收液的相對熒光強度值I_ACtij、I_ATtij，推算相應的活菌ATP濃度C_Atij和T_Atij；

在抗菌率R及抗菌活性值A計算中：

根據ATP低濃度標準曲線lgC_A-lgI_A的線性方程式Y＝a_AX+b_A，以0h接觸及24h或48h培養條件下每件對照樣品和抗菌樣品回收液的相對熒光強度測定值和作為基礎數據；在試驗有效條件下，計算其經24h或48h培養后的真菌增長值F_ij、G_ij以及抗菌率R_ij和抗菌活性值A_ij；對每組樣品的R_ij和A_ij取算術平均值得到相應的R_i和A_i；每批鍍膜抗菌玻璃樣品的抗菌率R和抗菌活性值A為其三組樣品R_i和A_i的算術平均值；并明確相關數據修約和測量不確定度要求；

在結果評價中：

參考衛生行業通用做法和相關抗菌產品標準要求，確定抗真菌性能分級判定標準；當某組(件)鍍膜抗菌玻璃樣品的抗菌率R_i(R_ij)或抗菌活性值A_i(A_ij)與其他兩組(四件)樣品的抗真菌性能相比至少相差一個水平級時，重新提取一組(件)樣品重復實驗；計算其經ATP生物熒光lgC_A─lgI_A標準曲線法測得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后兩組(件)鍍膜抗菌玻璃樣品抗真菌性能水平相同，則棄之；取另外兩組(四件)剩余樣品抗菌率R_i(R_ij)或抗菌活性值A_i(A_ij)的算術平均值作為該批次(組)鍍膜抗菌玻璃樣品抗真菌性能的評價結果。