[發明專利]一種用于豬胰島細胞的凍存復蘇方法及凍存液和復蘇液

有效

• 申請號: 201910193670.2
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109892319B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 王維;王佳;谷星石;李桑;徐暢
• 申請（專利權）人: 湖南賽諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 43114 長沙市融智專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 袁靖

本發明公開了一種用于豬胰島細胞的凍存復蘇方法及凍存液和復蘇液。本方法是在凍存前，使用海藻酸鈉包裹豬胰島細胞，在不影響正常代謝水平的前提下，構成相對穩定三維附著空間，使其在凍存?復蘇過程后保障穩定的回收率(>60％)和胰島素分泌功能，以達到建立胰島細胞庫的目的。

技術領域

本發明屬于動物胰島細胞超低溫保存技術領域，具體涉及一種可用于胰島細胞凍存-復蘇方法，以及凍存液和復蘇液。

背景技術

糖尿病是一種以高血糖為特征的內分泌疾病，長時間以來嚴重困擾著人類的健康，其產生的原因是患者體內胰島素分泌相對不足(Ⅱ型糖尿病)或者絕對不足(Ⅰ型糖尿病)。據2017年國際糖尿病聯盟(IDF)發布的第八版全球糖尿病地圖顯示全球患病人數已超過4億，而在我國糖尿病患者人數已達1.1億。目前治療糖尿病的主要方法為皮下注射外源性胰島素，這種方法雖然取得了顯著的療效但也引發了一系列諸如胰島素水腫、嚴重低血糖、過敏反應、皮下脂肪營養不良等副作用。早在1972年，Ballinger和Lacy便通過移植純化的胰島細胞治愈了兔的糖尿病(Ballinger&Lacy,1972)，而隨著胰島細胞移植技術的日趨成熟，這一技術已經逐漸成為一種可替代的糖尿病治療方法。但目前胰島供體嚴重不足這一問題，即便是采用異種移植(Xenotransplantation)、選擇豬作為胰島細胞供體，也可能會出現無法滿足短時間高需求的情況。所以，胰島細胞的長期保存成為了解決根本問題的關鍵。

目前，胰島細胞的長期保存主要通過凍存(Cryoperservation)來實現，多數胰島細胞凍存方法的核心是通過低溫降低細胞代謝以達到長期保存的效果，并借助凍存保護劑來減少在降溫過程中細胞團周邊溶液或細胞內部產生的冰晶，以保護細胞團的完整性(McGann et al.,1988)。但在0～-60℃這個溫度范圍區間，僅通過凍存保護劑不能完全避免冰晶對細胞團的損傷，這將嚴重影響細胞復蘇后的回收率、活率及功能，也無法滿足短時間獲得足量胰島細胞的需求。

胰島細胞的微囊化由于其具免疫隔離、生物相容性、通透性好等特點(Petruzzoet al.,1991；Zimmemerman et al.,1992；Calafiore et al.,1992；Cleland,1997；Dufrane et al.,2006；Safley et al.,2008)，多年以來一直被廣泛研究，而制備微囊的材料是決定微囊性能的關鍵因素，一般要求其成膜性、穩定性好，且具備適合進行移植的特點。目前研究報道較多的材料主要分為天然材料(瓊脂糖、神經鞘髓磷脂、海藻酸鹽、殼聚糖、明膠、纖維蛋白等)、半合成材料(羧甲基纖維素鈉、醋酸纖維素等)及合成材料(乳酸乙醇酸共聚物、聚氨基酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯等)這三類。而相較于半合成材料與合成材料的生物相容性及成本問題，天然材料所具備的無毒、免疫原性低、可降解且產物無毒副作用等特點，對于移植物的保護有更為深遠的意義。

海藻酸鹽是一種從海藻類植物(海帶、裙帶菜、紫菜等)中提純的陰離子多糖，這種線性聚合物由兩個基團組成，mannuronate(M)和guluronate(G)，它們分別以不同的濃度、排列方式分散在海藻酸鹽中。位于植物莖干部分海藻糖G基團濃度高，而葉片中的海藻糖M基團濃度更高，這一差別導致了植物不同部位的柔韌程度不同。對于胰島的微囊化而言，海藻酸鹽具有可以更快地與陽離子結合形成凝膠、接觸檸檬酸鹽會使陽離子脫離海藻酸鹽的結合還原為液體等特性(Martinsen et al.,1989；Morch et al.,2006)，使其成為胰島微囊化的最佳材料。