[發(fā)明專利]檢測還原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910192557.2
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109884031A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳劍峰;朱穎潔;高中才;徐華;郭磊;謝劍煒
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 蘇紅梅

本發(fā)明涉及一種基于表面增強拉曼光譜技術(shù)的檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，還涉及用于檢測GSH和/或GSSG的試劑盒。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒操作簡便、檢測速度快和靈敏度高，可以很好地應(yīng)用于烷基化試劑染毒細胞樣品中GSH和GSSG含量的測定，從而實現(xiàn)烷基化試劑快速篩查檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于表面增強拉曼光譜技術(shù)的檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，還涉及用于檢測GSH和/或GSSG的試劑盒。

背景技術(shù)

谷胱甘肽分為還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其中GSH的化學(xué)名稱為N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸，是細胞內(nèi)含量最高的非蛋白巰基化合物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抵御外源性毒物等重要生理功能。GSH和GSSG組成了細胞內(nèi)最重要的氧化還原系統(tǒng)之一，它們的比值GSH/GSSG是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，該比值通常保持在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)，但在異常生理條件下可能會發(fā)生改變。除了作為抗氧化劑，在細胞受到外源性毒物沾染時，GSH還可以通過直接或酶促的方式與親電試劑如鹵代烷烴、環(huán)氧化合物、重金屬離子等發(fā)生加合反應(yīng)保護細胞，降低損傷。因此，細胞內(nèi)GSH和GSSG的含量檢測可作為篩查GSH耗竭事件的重要指標(biāo)。

目前已有許多針對細胞中GSH和GSSG含量檢測試劑盒，多為基于酶循環(huán)方法和紫外-可見光吸收光譜(Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis)的分析檢測，通常能達到μM或nM的高靈敏度，但是其操作步驟較為繁瑣和耗時、成本較高。因此目前仍然需要開發(fā)快速、簡單、靈敏且能夠同時檢測細胞GSH和GSSG的產(chǎn)品，以實現(xiàn)對GSH耗竭事件的快速篩查確證。

表面增強拉曼光譜(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，簡稱SERS)技術(shù)是一種指紋光譜技術(shù)，具有分辨率高、實時分析、無損檢測、無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理、適合痕量分析等獨特的優(yōu)勢。目前，已有針對細胞中谷胱甘肽的SERS檢測方法，包括直接法和間接法兩種，其中直接檢測法受GSH和GSSG分子極化率低的影響，靈敏度很低；間接檢測法的操作復(fù)雜耗時，難以廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用DTNB(5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))與GSH迅速發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成TNB，將TNB作為高活性SERS探針，以原位還原法制備的固態(tài)納米銀基底作為SERS固態(tài)增強基底，成功區(qū)分DTNB和TNB信號，從而實現(xiàn)了GSH的間接檢測；對于GSSG，本發(fā)明首先用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)將GSH中的巰基掩蔽，然后用還原劑NaBH₄將GSSG還原為GSH，然后再對GSH進行檢測。本發(fā)明所建立的檢測方法操作簡便、檢測速度快和靈敏度高，可以很好地應(yīng)用于烷基化試劑染毒細胞樣品中GSH和GSSG含量的測定，從而實現(xiàn)烷基化試劑快速篩查檢測。

本發(fā)明的第一方面涉及一種試劑盒，包括：

SERS固態(tài)增強基底，和

5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。

在某些實施方案中，本發(fā)明第一方面所述的試劑盒中還包括：PB緩沖溶液或配制PB緩沖溶液的緩沖物質(zhì)(包括磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)，和/或PBS緩沖溶液或配制PBS緩沖溶液的緩沖物質(zhì)(包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉)，可選地，所述試劑盒還包括說明書。

本發(fā)明的第二方面涉及本發(fā)明第一方面所述的試劑盒用于檢測樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)的用途。

本發(fā)明的第三方面涉及一種試劑盒，包括：

SERS固態(tài)增強基底，

5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，

N-乙基馬來酰亞胺(NEM)，