[發(fā)明專利]一種由人多能干細(xì)胞分化獲得胰腺前體細(xì)胞及胰島β細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910190210.4
• 申請(qǐng)日: 2019-03-13
• 公開（公告）號(hào): CN109749986B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣衛(wèi);檀夢(mèng)天
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明提供了一種由人多能干細(xì)胞分化獲得胰腺前體細(xì)胞以及胰島β細(xì)胞的方法。在由人多能干細(xì)胞來源的內(nèi)胚層細(xì)胞向胰腺譜系細(xì)胞特化過程中，通過階段性加入WNT信號(hào)通路抑制劑可以提高人多能干細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞分化效率。本發(fā)明在提高胰腺前體細(xì)胞分化效率后，進(jìn)而提高成熟的胰島β細(xì)胞分化效率。該方法適用于不同細(xì)胞系的胰腺分化，獲得大量胰島β細(xì)胞，為糖尿病細(xì)胞治療、藥物篩選、疾病模型等提供有力的支持，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種由人多能干細(xì)胞分化獲得胰腺前體細(xì)胞和胰島β細(xì)胞方法。

背景技術(shù)

糖尿病是以血糖升高為特征的代謝性疾病。無論是免疫損傷引起的β細(xì)胞缺失導(dǎo)致胰島素分泌不足(T1D)，或是胰島素抵抗產(chǎn)生的血糖升高(T2D)，最終都會(huì)產(chǎn)生β細(xì)胞的損傷(Lam and Cherney,2018)。據(jù)世界糖尿病聯(lián)盟IDF在2017年的報(bào)道，現(xiàn)今已有4.25億的糖尿病患者，而這個(gè)龐大的患病人群可能在2045年會(huì)增至6.29億。糖尿病已經(jīng)不再是一個(gè)健康風(fēng)險(xiǎn)問題，它早已成為一個(gè)全球性的社會(huì)危機(jī)。糖尿病不僅會(huì)引起血糖升高，同時(shí)也伴隨著由糖尿病引起的并發(fā)癥，給其家庭和社會(huì)帶來種種負(fù)擔(dān)。目前，糖尿病的治療多數(shù)采用口服降糖藥物，胰島素注射，以及胰島素泵等。傳統(tǒng)的治療手段都只能緩解糖尿病的高血糖癥狀，并不能從根本上治療糖尿病。2000年，Shapiro等進(jìn)行了胰島分離后移植，再結(jié)合適宜的免疫抑制方案，達(dá)到了胰島素非依賴的療效(Shapiro et al.,2000)，后續(xù)觀察也取得了非常好的效果(McCall and Shapiro,2012)。胰島移植的方法可以從根本上治療糖尿病，但是由于供體極度缺乏該方法并沒能成為糖尿病的主要治療手段。胚胎干細(xì)胞，作為一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在體外通過相關(guān)的化學(xué)小分子和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)，即可得到相對(duì)成熟且有功能的組織或器官。利用干細(xì)胞定向分化來得到組織和器官的方法同樣可以用于糖尿病的治療，為供體不足提供了新的解決方案。可見，如何獲得從胚胎干細(xì)胞獲得大量的、有功能的胰島β細(xì)胞將極大利于糖尿病的細(xì)胞治療。

特異性標(biāo)記物的表達(dá)水平可用于指示細(xì)胞的分化階段與成熟程度，胰腺前體細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)志物為：胰腺十二指腸同源盒1(PDX1)和NK6同源蛋白1(NKX6-1)共表達(dá)，PDX1的表達(dá)標(biāo)志著細(xì)胞向胰腺方向分化，而PDX1和NKX6-1的表達(dá)標(biāo)志著細(xì)胞分化成為胰腺前體細(xì)胞，是人胰腺發(fā)育過程中的關(guān)鍵標(biāo)記物。胰島β細(xì)胞的特征行標(biāo)志物為轉(zhuǎn)錄因子PDX1持續(xù)表達(dá)和胰島素(INS)，而轉(zhuǎn)錄因子PDX1和INS共同表達(dá)則標(biāo)志著胰島β細(xì)胞的成熟。

WNT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制之一。該信號(hào)通路的活化可以引起β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積累，β-catenin與TCF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此影響細(xì)胞的增殖，分化，凋亡，遷徙。因此，在早期胚胎發(fā)育和器官形成中，WNT信號(hào)通路也起到了至關(guān)重要的作用。

由于胰腺以及胰島β細(xì)胞分化的復(fù)雜性和不同體系之間的差異性，造成難以得到重復(fù)性好、高效的胰島細(xì)胞分化方案，不能得到穩(wěn)定的，大量的胰腺前體細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效的由人多能干細(xì)胞分化獲得胰腺前體細(xì)胞和胰島β細(xì)胞方法。

本發(fā)明在定型內(nèi)胚層向胰腺前體細(xì)胞分化階段抑制WNT信號(hào)通路，建立的高效的胰腺前體細(xì)胞分化以及進(jìn)一步胰島β細(xì)胞分化的方案。

本發(fā)明階段性誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化獲得胰腺前體細(xì)胞及胰島β細(xì)胞的方法示意圖見附圖1。

本發(fā)明具體技術(shù)方案步驟如下：

1)人多能干細(xì)胞分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞：

a.配制定型內(nèi)胚層階段培養(yǎng)基1，將人多能干細(xì)胞使用所述培養(yǎng)基于37攝氏度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天；

b.配制定型內(nèi)胚層階段培養(yǎng)基2，將經(jīng)過上述步驟a培養(yǎng)后的細(xì)胞更換為定型內(nèi)胚層階段培養(yǎng)基2，于37攝氏度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天，每天更換培養(yǎng)基；