[發明專利]一種基因重組人促皮質素與白蛋白的融合蛋白及表達方法

在審

• 申請號: 201910186462.X
• 申請日: 2019-03-12
• 公開（公告）號: CN109734816A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 王大勇;黃永林;武新麗
• 申請（專利權）人: 王大勇
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70
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• 代理人: 暫無信息

人促皮質素又稱促腎上腺皮質激素（ACTH），目前是臨床治療兩歲以下嬰兒驚厥癥的唯一特效藥。人血清白蛋白（ALB）在體內具有穩定其它蛋白質的作用。本發明通過基因工程技術，優化設計并構建基因重組ACTH與ALB的融合蛋白表達質粒，并在BL21?DE3菌株中表達。ACTH與ALB通過組織型纖溶酶原激活劑的底物識別序列（tPAst）相連接起，tPAst在體內可以被組織型纖溶酶原激活劑識別并水解，從而可以逐漸釋放出游離的ACTH與ALB。

技術領域

本發明屬于基因工程制藥，涉及一種利用微生物表達的基因重組融合蛋白及其DNA和蛋白質序列，以及該融合蛋白的表達方法。

背景技術

促皮質素(Corticotropin)也稱促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂體的前葉、下丘腦、腎上腺髓質、腸道和胎盤等組織分泌的一種39個氨基酸的多肽類激素，具有調節糖、脂肪、和蛋白質的生物合成和代謝，調節心腦血管功能、提高抵抗力，調控糖皮質激素(GC)的合成與分泌，神經損傷恢復與再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是臨床治療兩歲以下嬰兒驚厥癥的唯一特效藥，該病發病率0.5％～1％，6～33％的嬰兒驚厥癥患兒在3歲前死亡，70～90％患兒智力發育緩慢，30％發展為自閉癥。ACTH也用于紅斑狼瘡、多發性硬化病急性惡化、腎病綜合征、全身性皮肌炎和結節病的治療；還用于銀屑病關節炎、風濕性關節炎、強直性脊柱炎以及嚴重眼部過敏和炎癥等的輔助治療。目前醫藥市場上流通的注射用人促腎上腺皮質激素(簡稱促皮質素，ACTH)主要有兩個來源：一是在動物臟器中提取，生產成本高并且有傳播動物病毒和支原體的潛在風險。二是由人工合成具有生物活性的ACTH前24肽，其工藝復雜、成本高、產量小、半衰期較短,并且化學合成的方法不易控制其產物旋光性。ACTH在血液中容易被蛋白酶降解，血漿半衰期很短。本發明從工程菌中表達制備基因重組ACTH融合蛋白，生產成本低，基本不會傳播動物病毒和支原體。

人血清白蛋白(ALB)是人體血液中含量最多的蛋白質，含有585個氨基酸，具有結合其它化合物、維持血液滲透壓、抗凝血、清除自由基、增強人免疫力和抵抗力等作用，其在體內的半衰期較長，約為19天。ALB制劑在臨床上廣泛用于燒傷和嚴重失血等引起的休克、急性缺血性腦卒中、腎病綜合癥、肝硬化、肺性腦病、糖尿病性腎病和皮膚潰爛等。人血清白蛋白可以保護與其結合的蛋白質不被血漿中的各種蛋白酶降解，從而延長蛋白質在血漿中的半衰期。

組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是血液中的一種蛋白酶，它可以特異性識別底物蛋白質當中的酶切識別位點序列“CPGRVVGG”(簡稱為tPAst)，并在該位點處將底物蛋白質切割成兩段。在本發明表達的融合蛋白中，以tPAst連接ACTH與ALB，形成融合蛋白結構ACTH-tPAst-ALB，當融合蛋白被注射入血液后，血液中tPA的作用下，ACTH-tPAst-ALB融合蛋白會逐漸釋放出游離的ACTH及ALB蛋白。

構建的表達ACTH與ALB的融合蛋白的表達質粒在本專利中稱為ACTH-tPAst-ALB-pET21a。其中tPAst為如上所述組織型纖溶酶原激活劑底物序列(氨基酸序列為CPGRVVGG)。

發明內容

1.發明的目的

利用工程菌表達及制備一種基因重組融合蛋白(ACTH-tPAst-ALB)的方法，ACTH與ALB通過tPAst氨基酸序列相連，tPAst在血液中可以被蛋白酶tPA識別并切割成兩段。

2.發明的技術方案

一、使用設計的引物以及重疊PCR技術將編碼ACTH、tPAst和ALB的核苷酸序列相連，構建兩端帶有內切酶位點(BamHI和SalI)的cDNA架構：BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI。

二、雙酶切BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及空白載體pET21a，產生互補的粘性末端。