[發明專利]一種用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統及其制備方法

在審

• 申請號: 201910182969.8
• 申請日: 2019-03-12
• 公開（公告）號: CN110055270A
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 仰大勇;郭小翠;白麗慧;余文婷;張雪
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12P21/00
• 代理公司: 天津一同創新知識產權代理事務所(普通合伙) 12231
• 代理人: 陸藝

1.一種雙巰基修飾的三枝狀DNA支架，其特征是由3種DNA單鏈組成，第1種DNA單鏈分為1-1段和1-2段，在1-2段的3’端連接有巰基；第2種DNA單鏈分為2-1段和2-2段，在2-2段的3’端連接有巰基；第3種DNA單鏈分為3-1段、3-2段和3-3段；第1種DNA單鏈的1-1段核苷酸序列與第3種DNA單鏈的3-2段核苷酸序列反向互補配對；第1種DNA單鏈的1-2段核苷酸序列與第2種DNA單鏈的2-1段核苷酸序列反向互補配對；第2種DNA單鏈的2-2段核苷酸序列與第3種DNA單鏈的3-1段核苷酸序列反向互補配對。

2.根據權利要求1所述的一種雙巰基修飾的三枝狀DNA支架，其特征是第1種DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；第2種DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；3-1段和3-2段之和的DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；3-3段的DNA單鏈的核苷酸數為22-26。

3.一種雙巰基修飾的三枝狀DNA支架的制備方法，其特征是包括如下步驟：

(1)取摩爾數相同的第1種DNA單鏈、第2種DNA單鏈和第3種DNA單鏈溶于80-100mM的NaCl水溶液中，混勻，置于PCR儀中，控制溫度由95-90℃，在0.8-2小時內降溫到25-4℃；

第1種DNA單鏈分為1-1段和1-2段，在1-2段的3’端連接有巰基；第2種DNA單鏈分為2-1段和2-2段，在2-2段的3’端連接有巰基；第3種DNA單鏈分為3-1段、3-2段和3-3段，第1種DNA單鏈的1-1段核苷酸序列能與第3種DNA單鏈的3-2段核苷酸序列反向互補配對；

第1種DNA單鏈的1-2段核苷酸序列能與第2種DNA單鏈的2-1段核苷酸序列反向互補配對；

第2種DNA單鏈的2-2段核苷酸序列能與第3種DNA單鏈的3-1段核苷酸序列反向互補配對；

(2)按第1種DNA單鏈和補骨脂素摩爾比為1：10-100的比例，向步驟(1)中加入補骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量為1-4J，獲得雙巰基修飾的三枝狀DNA支架。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征是所述第1種DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；第2種DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；3-1段和3-2段之和的DNA單鏈的核苷酸數為38-78個；3-3段的DNA單鏈的核苷酸數為22-26。

5.雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因，其特征是雙巰基修飾的三枝狀DNA支架的第3種DNA單鏈的3-3段連接有含有目標蛋白基因的DNA序列。

6.權利要求5的雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因的制備方法，其特征是包括如下步驟：向EP管中加入雙巰基修飾的三枝狀DNA支架，使終濃度為0.15-1.6μM，加入線性引物，使終濃度為0.15-1.6μM，加入含有目標蛋白基因的質粒，使終濃度為0.1-3ng/μl和1╳DNA聚合酶，用去離子水補齊50μl體系，置于PCR儀中，進行PCR擴增，得到雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因。

7.一種用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統，其特征是雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因中的雙巰基與金納米顆粒連接。

8.權利要求7的一種用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統的制備方法，其特征是包括如下步驟：向EP管中加入金納米顆粒和雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因，混合，于-20℃放置2-12小時，在室溫下，使體系融化，得到一種用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統；金納米顆粒與雙巰基修飾的三枝狀DNA支架修飾的基因的摩爾比為1:2-30。

9.一種用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統在無細胞蛋白質生產的應用，其特征是包括如下步驟：按體積比為(10-20):(15-35):1的將細胞提取物，補充緩沖液，用于提高無細胞蛋白表達的基因載體系統混合，加入終濃度0.4-1.2mM異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于恒溫反應容器中，在30℃表達目標蛋白。