[發明專利]抗人內皮蛋白C受體的羊駝單域抗體及應用

有效

• 申請號: 201910178576.X
• 申請日: 2019-03-11
• 公開（公告）號: CN109897108B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 丁衡
• 申請（專利權）人: 上海恒賽生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;G01N33/68;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了抗人內皮蛋白C受體的羊駝單域抗體及應用。本發明利用噬菌體展示技術對羊駝噬菌體抗體庫進行多輪篩選，富集能夠特異結合人蛋白C受體的噬菌體；通過對噬菌體培養，制備抗體并鑒定獲得陽性克隆，通過測序獲得其相應的編碼序列。本發明中的抗體保持對EPCR的高結合能力，可用于EPCR的表達檢測；本發明的抗體可與蛋白C競爭性結合EPCR，從而阻止蛋白C?EPCR的信號通路激活，用于以蛋白C?EPCR信號通路為靶點的疾病治療。

技術領域

本發明涉及抗人內皮蛋白C受體的抗體，特別涉及新的抗人內皮蛋白C受體的特異性單域抗體，及其可變區的DNA編碼序列，還涉及所述單域抗體的應用。

背景技術

內皮蛋白C受體(endothelial protein C receptor,EPCR)是蛋白C抗凝途徑新發現的成員，也是繼血栓調節蛋白之后在腫瘤細胞表面發現的另一種與抗凝相關的蛋白。研究表明蛋白C受體可通過與活化的蛋白C(APC)結合激活蛋白酶活化受體(PAR-1)，促進細胞增殖及抑制凋亡，EPCR在此過程中起著關鍵的介導作用；最近的研究表明活化的蛋白C能夠通過與EPCR及PAR-1結合提高乳腺癌細胞株的遷移性和趨化性，揭示細胞和組織中EPCR的過度表達有利于其增殖，抑制細胞凋亡，從而促進腫瘤的進展和轉移。目前EPCR的功能包含了參與抗凝、調節炎癥反應和抑制細胞凋亡、參與腫瘤耐藥和轉移等。

人EPCR的開放閱讀框含有714個核苷酸，編碼238個氨基酸，在加工過程中去除17個氨基酸信號肽，即成為221個氨基酸組成的成熟蛋白。EPCR由胞外區、跨膜區和一個短的高度保守的胞漿區組成。細胞膜上的EPCR屬于結合型受體，研究證實EPCR在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸癌、惡性膠質瘤、黑色素瘤等多種腫瘤細胞及白血病細胞中均具有表達，尤其是在惡性實體瘤當中。EPCR基因在多種腫瘤細胞中高表達提示其可作為癌癥診斷的腫瘤標記物。

駱駝科動物如雙峰駝、單峰駝、羊駝和美洲駝中存在一種缺少輕鏈，僅由重鏈組成、但具有完整功能的抗體，稱為重鏈抗體(heavy chain antibody，hcAb)。與常規抗體一樣，重鏈抗體可變區具有很好的抗原識別和結合能力，能夠正常行使抗體的功能。重鏈抗體的可變區(variable domains of the hcAb，簡稱為VHH)，分子量約為15kDa，僅為常規抗體大小的1/10，是目前可以得到的具有完整抗體功能的最小分子片段，稱為單域抗體(singledomain antibody，sdAb)。駱駝單域抗體的抗原結合區僅由VHH的三個超變區(H1-H3)組成，在空間上形成了與常規抗體典型結構不同的抗原結合域。其中H3的平均長度比常規抗體長，在空間上呈突出的指狀結構，因此單域抗體可以結合一些常規抗體無法接近的抗原表位。另外，由于在框架區FR2中有四個位點被親水性氨基酸替換，重組VHH在大腸桿菌中可以獲得高表達。

獲得單域抗體基因序列的方法是通過噬菌體抗體庫進行篩選。噬菌體抗體庫是用基因克隆技術將羊駝全套sdAb可變區基因克隆出來，組裝到表達載體內并表達到噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體。噬菌體抗體庫的篩選包括兩個主要步驟淘選和鑒定：淘選是將噬菌體抗體庫與目的抗原共同孵育，通過幾輪洗脫，收集結合的噬菌體，將獲得的噬菌體感染細菌并擴增，再進行下一輪的淘選，經幾輪淘選后便可富集到與目的抗原特異性結合的噬菌體感染的多克隆菌株；鑒定過程是從噬菌體感染的多克隆菌株中挑選出單克隆菌株，即將淘篩出的噬菌體感染細菌、鋪板、挑選，即可得到高特異性單克隆菌株，通過基因測序，分析比對后即可獲得相關抗體的可變區基因序列及其編碼蛋白質。鑒定后的單域抗體進一步進行克隆構建，選擇適當的載體進行表達后即可得到單域抗體。單域抗體與IgG及scFv抗體相比，具有分子小、免疫原性低、穿透力強等優點，使得在基礎研究、藥物開發等領域有廣闊的應用前景。

截止目前，還未見利用人類EPCR的全長作為目的抗原，用羊駝噬菌體抗體庫進行抗人內皮蛋白C受體的抗體篩選。

發明內容