[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910171552.1
• 申請日: 2015-12-31
• 公開（公告）號: CN109897839B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉松;童理明;陳堅;堵國成
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N9/96;C07K19/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，特別是一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。通過在成熟酶的N端的融合表達雙親短膚實現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，特別是一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

背景技術(shù)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，是一種能夠發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應，最后形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵的蛋白。基于上述催化反應的存在，TGase能夠促使各種蛋白質(zhì)分子間、分子內(nèi)交聯(lián)以及谷氨酰胺殘基的水解，從而提高蛋白質(zhì)的各種功能性質(zhì)，比如乳化性、溶解性等；同時，TGase能夠通過將一些小分子物質(zhì)比如賴氨酸等引入蛋白質(zhì)，來增加蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。因此，市場上廣泛應用TGase作為別具特色的食品添加劑于面制品、乳制品、碚烤制品、肉制品及水產(chǎn)品等食品的加工處理，市場需求量極其巨大。TGase特殊的催化能力使其在食品、紡織等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛應用，但其催化活性較低、熱穩(wěn)定性較差，使得TGase作為優(yōu)良的催化劑在工業(yè)中的應用受到了嚴重限制。因此，目前的研究的熱點大部分都集中于如何提高TGase的熱穩(wěn)定性。因此基于已得到的在大腸桿菌中的表達平臺,通過在成熟酶的N端插入短肽,對進行分子改造,以期得到酶學性質(zhì)更適合工業(yè)應用的TGase。

自組裝雙親短肽(SAPs)通過疏水親水氨基酸交替分布，自發(fā)組裝成特殊短肽，形成的水凝膠能夠?qū)Φ鞍椎却蠓肿舆M行固定化，在分子電子學、細胞培養(yǎng)、納米生物技術(shù)和生物醫(yī)藥等方面具有巨大的應用潛力。SAPs與蛋白末端融合，能提高酶的催化效率和熱穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是得到一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，通過在成熟酶的N端的融合表達雙親短膚實現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性的提高，序列如SEQ ID NO.1所示或在SEQID NO.1基礎(chǔ)上進行缺失、突變后谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性保持不變的氨基酸序列。

所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列還可以如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示。上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶均在成熟酶的N端融合了雙親短肽序列。

為解決上述問題技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下示例：

1、雙親短膚基因的獲得，根據(jù)雙親短膚的氨基酸序列，在引物上設(shè)計相應的DNA序列。

2、以S.hygroscopicus pro-TGase表達質(zhì)粒pET-22b(+)/pro-TG(Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W,Chen K,Du G,Chen J,Zhou Z.The order of expression is a keyfactor in the production of active transglutaminase in Escherichia coli byco-expression with its pro-peptide.Microb Cell Fact,2011,10(112):1-7)為模板，進行全質(zhì)粒PCR。

3、將連接好的pET-22b(+)/pro-SAP-TG轉(zhuǎn)進JM109，測序正確后轉(zhuǎn)進E.coli BL21(DE3)。

培養(yǎng)基：

種子培養(yǎng)基(LB)：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，(pH 7.0)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(TB)：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄ 72mmol/L，KH₂PO₄ 17mmol/L，(pH 7.0)。

培養(yǎng)方法：

種子培養(yǎng)條件：LB培養(yǎng)基，用250mL搖瓶培養(yǎng)，裝液量為10％，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)時間為10h。