[發(fā)明專利]用于生產含有納米顆粒的耐酸大珠的方法和該大珠用于引發(fā)免疫應答的用途

在審

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• 申請日: 2019-03-06
• 公開（公告）號: CN110251483A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設計）人: D·尼祿博;A·坦蒂瓦萬特
• 申請（專利權）人: 奧地利商艾爾柏有限公司
• 主分類號: A61K9/51
• 分類號: A61K9/51;A61K47/36;A61K39/215;A61P31/14;C12N15/11
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

本發(fā)明涉及用于生產包含藻酸鹽/殼聚糖納米顆粒的藻酸鹽/殼聚糖耐酸大珠的方法和手段，其中，該納米顆粒包含生物活性劑，其中，該生物活性劑通過物理化學相互作用與聚合物相關聯(lián)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的納米顆粒和/或大珠以及用于在動物中引發(fā)免疫應答中使用的此類納米顆粒和/或大珠。本發(fā)明還包括如本文所定義的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)抗原用于生產納米顆粒或耐酸大珠和包含此種抗原的疫苗的用途。

技術領域

本發(fā)明涉及用于生產包含藻酸鹽/殼聚糖納米顆粒的藻酸鹽耐酸大珠的方法和手段，其中，該納米顆粒包含生物活性劑，其中，該生物活性劑通過物理化學相互作用與聚合物相關聯(lián)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的納米顆粒和/或大珠，以及用于在動物中引發(fā)免疫應答中使用的此類納米顆粒和/或大珠。本發(fā)明還包括如本文所定義的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)抗原用于生產納米顆粒或耐酸大珠和包含此種抗原的疫苗的用途。

背景技術

諸如DNA或蛋白的生物活性劑經由胃進入腸道并任選地隨后進入血液的遞送受到胃中條件的阻礙，該條件包括酸性環(huán)境以及蛋白酶或核酸酶的存在。這些條件在蛋白和核酸可在腸道中被吸收之前提供蛋白和核酸的分解或破壞。因此，需要保護這些生物活性劑免于降解。改善胃腸道中蛋白或核酸攝取的一種可能方式是將它們包封在膠體納米顆粒中，該膠體納米顆粒保護生物活性劑不被降解并促進其輸送到體循環(huán)中。

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是生物活性劑的一個示例。PEDV，冠狀病毒(Coronaviridae)科中的一種RNA病毒，是豬流行性腹瀉(PED)的病原體。PED是一種破壞性腸道疾病，其特征是嘔吐和嚴重的水樣腹瀉導致死亡。所有年齡的豬都易患PED，但在一周齡以下的豬中觀察到高死亡率。不到一周齡的感染豬的死亡率高達100％。

為在爆發(fā)期間成功控制PEDV，長期以來一直建議有計劃地將雌豬暴露于PEDV感染豬的碎腸。然而，已經觀察到此種管理方案的副作用，包括木乃伊化胎兒的百分比增長和其他病原體污染的風險。為預防畜群再次感染PED，已經實施了用改性活PEDV疫苗或殺滅PEDV疫苗進行肌肉內疫苗接種作為替代工具。然而，嘗試用改性活PEDV疫苗和殺滅PEDV疫苗對豬進行肌肉內免疫已經顯示出不同程度的成功。密集使用PEDV疫苗的畜群仍經歷PED爆發(fā)。接種疫苗的方式導致不成功的結果。因為粘膜免疫，特別是分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，在控制PEDV感染中起重要作用，所以用PEDV疫苗進行肌肉內疫苗接種不是完全有效的，并且不會引起粘膜免疫。由于口服PEDV疫苗尚無法在市場上買到這一事實，農民嘗試通過在產仔前給雌豬口服施用PEDV感染豬的碎腸來刺激粘膜免疫。然而，此種方法也取得不同程度的成功。原因如下：成功引起粘膜免疫應答的施用到雌豬的感染豬的碎腸中PEDV的劑量是不充分的和變化的。另外，存在被其他有害病原體污染的風險并且在畜群中引入活病毒有導致PED爆發(fā)的風險。

到目前為止，一些納米顆粒口服遞送系統(tǒng)已用于口服疫苗接種。例如，聚乙烯亞胺(PEI)已經用于將質粒DNA遞送到免疫細胞中。PEI含有伯胺，該伯胺可與質粒DNA的磷酸基團相互作用以形成稱為聚合復合物(polyplex)的復合物，該聚合復合物可增強通過胞吞作用進入細胞內的質粒DNA的攝取。雖然PEI在將質粒DNA遞送進入細胞方面具有高效率，但PEI的應用受到其細胞毒性和與血清蛋白非特異性結合的阻礙。

一種可選的方法是由藻酸鹽包覆的聚合復合物的制備。此種方法將減少凈電荷，從而降低細胞毒性并在血清存在下增強質粒DNA進入細胞中的遞送。但是，當口服給藥時，上述系統(tǒng)不能保護質粒DNA在腸道中免于降解。另一種方法是制備藻酸鈣納米顆粒以防止質粒DNA在腸道中降解。為了更好的酸防護，可添加殼聚糖。殼聚糖還起到粘膜粘著劑的作用，這將增加藻酸鈣納米顆粒的保留時間，隨后增加被免疫細胞的攝取。雖然含有殼聚糖的藻酸鈣納米顆粒可防護質粒DNA被腸道中的酸性環(huán)境降解，但納米顆粒將質粒DNA遞送進入免疫細胞中的效率不如聚合復合物有效。