[發明專利]一種基于同源重組的變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建方法與應用

在審

• 申請號: 201910167674.3
• 申請日: 2019-03-06
• 公開（公告）號: CN109880844A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 凌軍;劉鳳權;朱潤杰;蔣天萍;賈藝凡
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

本發明公開了一種基于同源重組的變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建方法與應用，屬于微生物基因工程技術領域。本發明利用自殺質粒構建用于基因敲除的重組載體，將重組載體轉入S17?1λpir感受態細胞中，通過接合的方式將重組載體轉入到變棕溶桿菌中，并在含慶大霉素抗性培養基上和含蔗糖培養基上分別進行一次交換子和二次交換子的篩選，再利用PCR進行突變體篩選獲得基因敲除突變體。利用該敲除系統成功敲除變棕溶桿菌OH23中的兩個基因，證明該系統適用于抗生素溶桿菌的基因功能研究，為其小分子代謝產物生物合成、遺傳調控和作用機制研究奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及微生物基因工程領域，具體涉及一種基于同源重組的變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建方法與應用。

背景技術

溶桿菌廣泛存在自然界中，分類地位上屬于黃單胞科（Xanthomonadaceae），溶桿菌屬（Lysobacter），能夠產生多種胞外水解酶和小分子抗菌物質，對農作物產生病害的細菌、真菌、卵菌及線蟲產生顯著的拮抗作用。

變棕溶桿菌OH23（Lysobacter brunescens）為本實驗室分離于植物根際土壤一株革蘭氏陰性細菌。OH23能夠特異性的拮抗水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae PXO99A）、水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae RS105）、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC）、野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pathovars）、地毯草黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.glycines）等黃單胞菌。由于溶桿菌對許多抗生素有抗性，且敏感的抗生素種類也不相同，導致溶桿菌的基因敲除系統不易構建，而且不同溶桿菌甚至同一個種的不同菌株其有效的基因敲除系統也不相同，不能共用。因此，針對變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建，有助于對OH23進行分子操作，特別是可為其小分子代謝產物生物合成、遺傳調控和作用機制研究奠定基礎。

發明內容

針對現有技術中變棕溶桿菌OH23的基因敲除系統不能共用的問題，本發明的目的在于提供一種基于同源重組的變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建方法與應用，構建方法簡單，有助于對OH23進行分子操作，尤其為其小分子代謝產物生物合成、遺傳調控和作用機制研究奠定基礎。

一種基于同源重組的變棕溶桿菌OH23基因敲除系統的構建方法，利用含有慶大霉素抗性基因的自殺質粒pJQ200SK構建用于基因敲除的重組載體，將重組載體轉入接合用S17-1λpir感受態細胞中，通過接合的方式將重組載體轉入到具有利福平抗性的OH23中，并在含利福平和慶大霉素抗性培養基上進行一次交換子，進而通過pJQ200SK載體所帶的sacB蔗糖致死基因進行二次交換子的篩選，再利用PCR進行突變體篩選獲得基因敲除突變體。

作為改進的是，所述的自殺質粒為質粒pJQ200SK。

作為改進的是，上述構建方法包括以下步驟：

步驟1，構建重組載體

設計目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR擴增目的基因的上下游同源臂；將自殺質粒與上下游同源臂利用相應的內切酶進行酶切并連接得到用于基因敲除的重組載體；將重組載體以電轉化方式轉入S17-1λpir感受態細胞中，將細胞涂布于含慶大霉素抗性培養基上培養，至于37℃靜置培養，進而獲得含有重組載體的S17-1λpir大腸桿菌；

步驟2，重組載體轉入變棕溶桿菌OH23