[發明專利]使用雜合CHEF1啟動子的改善重組蛋白表達

在審

• 申請號: 201910162032.4
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN110042122A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 霍華德·R·克拉可
• 申請（專利權）人: AGC生技制品公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 劉偉;蔡麗

本發明提供用于高水平表達重組蛋白的表達載體和宿主細胞。所述表達載體包含中國倉鼠卵巢延長因子1?α(CHEF1)轉錄調控DNA元件和巨細胞病毒(CMV)啟動子和/或人腺病毒三聯前導(AdTPL)序列。與以前描述的表達系統相比，本發明實現宿主細胞的增加蛋白表達和更好的產率。

本申請含有呈計算機可讀形式的序列表(文件名：44744A_seqListing.txt；大小：37,528字節；創建：2014年3月11日)作為公開內容的單獨部分，所述內容以全文引用的方式并入本文。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2013年3月12日提交的美國臨時專利申請序列號61/777,603的優先權的權益。所述優先權申請的公開內容以引用的方式并入本文。

技術領域

本發明針對包含新穎啟動子-增強子組合的表達載體，所述啟動子-增強子組合增強異源蛋白表達并且在重組蛋白生產的領域中具有實際應用。

背景技術

通過轉錄、翻譯、蛋白質折疊和/或分泌中的改善而增加的重組蛋白表達是基本優先的用于在細胞系發展期間優化產量。中國倉鼠卵巢延長因子1-α(CHEF1)表達系統已經被廣泛使用以創建用于產生重組蛋白的臨床細胞系。延長因子1-α(EF-1α)基因在大多數組織類型中高度表達，并且EF-1是人細胞中最豐富的蛋白質之一(Beck等，Molecular SystemsBiology 7：549；2011)。CHEF1表達載體實現在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中以及在非倉鼠細胞中的高水平重組蛋白表達。

CHEF1表達與生長相協調，使得滴定度增加由增加的體積產率來驅動。通常，蛋白表達在生長的指數期早期啟動并且在靜止期期間下降且衰退。蛋白表達和細胞生長之間的聯系與天然EF-1α基因的調控是一致的，所述天然EF-1α基因被組成型表達以在核糖體蛋白復合物中發揮作用。EF-1α的表達已經被證明在轉化的細胞(Sanders等，Nucleic AcidsResearch 20：5907；1992)和絲裂原刺激的細胞(Thomas和Thomas，Journal ofCellBiology 103：2137；1986)中增加，這與EF-1α在活躍生長細胞中的組成型表達是一致的。除了生長的細胞的轉錄控制，胰島素生長因子通過mRNA 5′非翻譯區(5′UTR)來調控EF-1α的翻譯(Hammond和Bowman，Journal of Biological Chemistry 25：17785；1988；Proud和Denton，Biochemical Journal 328：329；1997)。通過在5′UTR中發現的多嘧啶系統(TOP)序列來實現這種翻譯控制(Mariottini和Amaldi，Molecular and Cellular Biology 10：816；1990)。

CHEF1表達系統已經示出能夠實現比采用其他常用啟動子(例如，巨細胞病毒(CMV)、人EF-1α以及猿猴病毒40(SV40)啟動子)的載體更高水平的蛋白表達(Running Deer和Allison，Biotechnology Progress 20：880；2004)。CMV啟動子是用于重組蛋白表達最廣泛使用的啟動子之一。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系統使用鼠科或人CMV啟動子(Kalwy，S.，″Towards stronger gene expression-a promoter′s tale，″第19屆歐洲動物細胞技術(ESACT)學院會議，2005)。商業表達質粒pcDNA^TM3(Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA)攜帶來源于之前描述的主要立即早期(IE)基因(GenBank Accession#K03104.1)的CMV啟動子(Boshart等，Cell 1985；4：521)。另一個常用的CMV啟動子來源于人CMV株AD 169(GenBank Accession#X17403.1)，也稱為人皰疹病毒5。