[發(fā)明專利]鑒定冬瓜雜種種子純度的SSR分子標記引物及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-03-05
• 公開（公告）號: CN110029184B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉政國;凌志陽;陳慶明;陳勇;歐偉紅;陳婕英
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué);南寧科農(nóng)種苗有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南寧市吉昌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 45125
• 代理人: 滕藝瓊

1.一種鑒定冬瓜雜種種子純度的SSR分子標記引物，其特征在于：所述冬瓜雜種種子的母本為黑皮冬瓜類，父本為綠皮節(jié)瓜類或黑皮節(jié)瓜類；所述SSR分子標記引物上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.權(quán)利要求1所述的SSR分子標記引物在鑒定冬瓜雜種種子純度中的應(yīng)用，其特征在于：所述冬瓜雜種種子的母本為黑皮冬瓜類，父本為綠皮節(jié)瓜類或黑皮節(jié)瓜類。

3.使用權(quán)利要求1所述的SSR分子標記引物鑒定冬瓜雜種種子純度的方法，其特征在于，步驟如下:

(1)提取冬瓜父母本和雜種種子的DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，以SSR分子標記引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；

(3)將電泳產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；

(4)觀察電泳檢測結(jié)果，將父母本與雜交種子的帶型進行對比，父本具有1條共顯性特征帶和1條顯性特征帶，母本具有1條共顯性特征帶，同時具有父母雙親本的3條特征帶的種子鑒定為真正的雜交種，缺少父本或母本特征帶的均視為假雜種，種子的純度按如下方法計算：

雜種純度＝檢測到的真雜交種個數(shù)/種子檢測總數(shù)×100％。

4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(1)中以CTAB法提取冬瓜父母本和雜交種子的DNA。

5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(2)的PCR擴增程序為：95℃5min，95℃30s，56℃45s,72℃1min30s循環(huán)35次，72℃7min，終止。

6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(3)的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法為：

①制備凝膠：用洗滌劑洗凈一塊平板和一塊凹板,晾干備用；用70％乙醇將平板和凹板擦拭干凈；用夾子夾好兩板，平放在水平面上；配制40ml膠液，輕輕搖勻，并緩慢注入兩塊玻璃板的空隙處，灌滿，保持注入溶液的連續(xù)性，若有氣泡要及時去除；將點樣梳插入玻璃板，注意去除氣泡，且不要將梳子全部插入；室溫下放置，丙烯酰胺開始聚合，1.5h后凝膠聚合完畢；

②電泳：在上下電泳槽內(nèi)加入0.5×TBE,小心取出點樣梳，用微量上樣器上樣，上樣量0.8μl，接上電極，開啟電源，230v恒壓電泳80min；倒棄電泳緩沖液，取下玻璃板于工作臺上，用單面刀片從兩板底部輕輕撬起凹板，將平板放入大塑料皿內(nèi)進行染色；

③銀染：包括固定、沖洗、染色、水洗、顯影、沖洗步驟：

固定：在1340ml蒸餾水中加入150ml無水乙醇，10ml冰醋酸，配好固定液；將平板放入，固定5min，直至指示劑消失；

沖洗：用蒸餾水漂洗凝膠2次，每次2min；凝膠從水中取出后，控水10～20s；

染色：在1500ml蒸餾水中加入1.5g硝酸銀，配好染色液；將凝膠轉(zhuǎn)入染色液中，緩慢搖動，染色8min；

水洗：將染好色的凝膠放入蒸餾水中沖洗10s，迅速取出控水；

顯影：在1500ml蒸餾水中加入22.5g氫氧化鈉，6ml甲醛，配好顯影液；把凝膠放入顯影液中，緩慢搖動10min以上，直到條帶顯現(xiàn)為止；

沖洗：用蒸餾水漂洗凝膠2min，置于室溫下自然晾干。

7.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：在步驟(4)中，父本具有1條共顯性特征帶和1條顯性特征帶，母本具有1條共顯性特征帶，其中父母本的共顯性特征帶為270bp或280bp，父本的顯性特征帶為240bp或320bp。