[發(fā)明專利]一種無毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌重組ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910159102.0
• 申請日: 2019-03-04
• 公開（公告）號: CN109745554B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉瑩;陳小云;杜吉革;薛麒;朱真;王磊;張瑩輝;印春生;李啟紅;姚文生;康凱
• 申請（專利權(quán)）人: 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;A61K39/116;A61P31/04
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

本發(fā)明涉及一種無毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌重組ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生產(chǎn)方法。該疫苗含有的無毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX突變體和CPA的C末端融合蛋白rETX_m3CPA_C是通過將無毒性的ETX突變體ETX_m3和CPA的C末端(CPA_C)進(jìn)行串聯(lián)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空間構(gòu)象，從而保持其免疫原性；又避免了包涵體變性復(fù)性的繁瑣工藝對抗原蛋白免疫原性的影響，減少了疫苗的制備時間和生產(chǎn)成本。在rETX_m3CPA_C的C端含有6個組氨酸(6*His)標(biāo)簽，便于蛋白的純化；獲得的毒素融合蛋白在小鼠體內(nèi)完全無毒，且在家兔模型中呈現(xiàn)良好的安全性、免疫原性和免疫保護(hù)性。疫苗還具有制備工藝簡單，疫苗效力優(yōu)良、同時預(yù)防A和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種無毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌重組ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生產(chǎn)方法。屬于獸用生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringeris)是一種重要的人畜共患菌，能引起創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊猝疽、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、牛羊腸毒血癥，不僅威脅著人類的健康，而且對畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌病具有發(fā)病急、病程短且死亡率極高的特點(diǎn)，一旦發(fā)病，往往還來不及治療就因外毒素中毒而發(fā)生猝死，因此免疫接種是防控該病的有效方法(陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2013:194-196.)。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是滅活疫苗，該類疫苗在預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌方面雖然取得了一定的效果，但這些疫苗在使用過程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起動物局部炎癥及毒性反應(yīng)等；其在制備過程中涉及外毒素的滅活，存在毒素外泄或滅活不徹底等生物安全隱患；此外，培養(yǎng)上清中的各種微小毒素以及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物往往成為免疫動物的致敏原，接種動物易產(chǎn)生不良反應(yīng)，導(dǎo)致免疫效果下降甚至免疫失敗。因此，開發(fā)安全性好、有效抗原含量高、免疫原性強(qiáng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未來的發(fā)展方向。

產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素。但目前為止，已發(fā)現(xiàn)的外毒素至少有20種，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)這4種外毒素最為主要，并可據(jù)此將該菌分為A，B，C，D，E 5個毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridium perfringensextracellular toxins and enzymes:20and counting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。

CPA是由產(chǎn)氣莢膜梭菌染色體基因plc編碼，plc存在于五個毒素型的菌株，但在A型毒株中表達(dá)水平最高。成熟的CPA由370個氨基酸構(gòu)成，分為N-末端(1-246，CPA_N)和C-末端(247-370，CPA_C)兩個結(jié)構(gòu)域。其中，CPA_N是CPA發(fā)揮酶活性的主要區(qū)域，而CPA_C是毒素與細(xì)胞結(jié)合的主要區(qū)域。研究表明，重組CPA仍存在一定的毒力，而通過甲醛滅活后的天然毒素抗原性會明顯降低(Byrne,M.P；Smith,L.A.Development of vaccines for preventionof botulism.Biochimie 2000,82,955-966)。為此，研制無毒力的重組CPA具有重要的意義。已有的研究表明，CPA的無毒區(qū)域CPA_C能夠?qū)μ烊籆PA起到良好的免疫保護(hù)作用，但由于CPA_C蛋白分子量較小，研究者通常選擇將CPA_C與GST等大分子量標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)，從而引入了過多無關(guān)的抗原成分。