[發(fā)明專利]一種熒光原位雜交的前處理液及前處理方法

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• 申請日: 2019-02-22
• 公開（公告）號: CN109975095A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁鳳;薛璞;王琦;余佶彥;王皎潔;許佳波;王芳
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉興雅康博醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N21/64
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種熒光原位雜交的前處理液及前處理方法。所述前處理液包含弱酸緩沖液、1?5％的非離子表面活性去污劑及10?30％的甘油。優(yōu)選地，所述弱酸緩沖液是檸檬酸鹽溶液，包含檸檬酸三鈉二水和檸檬酸一水。所述前處理方法包括對石蠟包埋的組織切片進(jìn)行烤片處理之后，用本發(fā)明的前處理液處理切片，用一步處理取代常規(guī)操作中的三步二甲苯脫蠟、三步乙醇梯度復(fù)水、預(yù)處理等7個步驟。本方法在保證實驗效果的前提下，縮短了前處理時間、簡化了操作流程，并且用安全的試劑取代了二甲苯等有毒性的試劑，安全環(huán)保。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種石蠟包埋切片熒光原位雜交的前處理液以及相應(yīng)的前處理方法。

背景技術(shù)

福爾馬林固定的石蠟包埋(Formalin-fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE)切片是病理學(xué)的核心材料，是術(shù)后或者活檢的組織學(xué)樣本，經(jīng)福爾馬林固定、酒精脫水、二甲苯透明、液態(tài)石蠟浸潤后被制作成石蠟包塊。對包塊進(jìn)行切片后，貼于載玻片得到石蠟包埋切片(以下簡稱切片)，廣泛應(yīng)用于HE、免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交等分子病理檢測技術(shù)中。

熒光原位雜交(FISH)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)相結(jié)合的新技術(shù)，其原理是利用熒光標(biāo)記的DNA探針與樣本DNA的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行雜交，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳病診斷、病毒感染分析、產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組研究等許多領(lǐng)域。

為了使石蠟包埋切片能夠用于FISH實驗，首先必須進(jìn)行脫蠟和前處理。而前處理是熒光原位雜交實驗中目標(biāo)DNA充分暴露且與探針結(jié)合的關(guān)鍵步驟之一。前處理的目的，在于打開由福爾馬林固定導(dǎo)致的大分子之間的交聯(lián)，使整個細(xì)胞呈松散狀，便于后續(xù)的蛋白酶對蛋白質(zhì)的消化分解。不充分的前處理會導(dǎo)致酶消化不完全，DNA不能夠充分暴露進(jìn)而導(dǎo)致雜交效果差甚至雜交失敗。

目前FFPE樣本的前處理需經(jīng)過烤片、脫蠟、復(fù)水、預(yù)處理、酶消化等多個步驟，然后再進(jìn)行雜交、洗滌及DAPI復(fù)染。從脫蠟到預(yù)處理整個過程大約需要65-85分鐘，且會使用二甲苯、硫氰酸鈉等有毒、有刺激性氣味的化學(xué)試劑。二甲苯對眼睛及上呼吸道均有強(qiáng)烈的刺激作用，高濃度時對神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用，而且實驗室必須有通風(fēng)櫥或全排式生物安全柜才能使用；硫氰酸鈉會引起以神經(jīng)、消化系統(tǒng)和皮膚損害為主的全身性疾病。這些有毒害試劑不但對操作人員的自身安全存在隱患，對實驗室設(shè)施要求更高，而且對企業(yè)后續(xù)處理這些化學(xué)品廢棄物的投入成本更高。因此，在保證實驗效果的前提下，若能夠縮短前處理時間、簡化前處理步驟且達(dá)到環(huán)保的目的，將會大幅提升工作的效率、提高實驗人員的安全性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種前處理液，其包含弱酸緩沖液、非離子表面活性去污劑及甘油。優(yōu)選地，所述非離子表面活性去污劑選自Triton X-100、Tween-20、NP-40中的至少一種，更優(yōu)選Triton X-100、Tween-20、NP-40中的一種，例如Triton X-100。優(yōu)選地，所述弱酸緩沖液是檸檬酸鹽溶液，包含0.005-0.015M的檸檬酸三鈉二水(或稱檸檬酸三鈉二水合物)，和0.0015-0.0025M的檸檬酸一水(或稱檸檬酸一水合物)。優(yōu)選地，所述檸檬酸鹽溶液包含0.01M的檸檬酸三鈉二水，和0.002M的檸檬酸一水。

所述檸檬酸鹽溶液的pH值為6.0-9.0，優(yōu)選為6.0。

本發(fā)明的前處理液包含1-5％的非離子表面活性去污劑，優(yōu)選1％。

本發(fā)明的前處理液包含10-30％的甘油，優(yōu)選10％。

本發(fā)明還涉及一種熒光原位雜交的前處理方法，其包括在對石蠟包埋的組織切片進(jìn)行烤片處理之后，用上述前處理液處理切片。

優(yōu)選地，前處理液的處理時間為10-60分鐘，處理溫度為80±15℃。

更優(yōu)選地，前處理液的處理時間為25分鐘，處理溫度為80±1℃。