[發明專利]一種熱穩定口蹄疫O型重組病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910147243.0
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN109810954A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 李平花;劉在新;盧曾軍;高雅;杜平;孫普;白興文;李冬;曹軼梅;付元芳;馬雪青;李坤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/66;C12N15/86;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種熱穩定口蹄疫O型重組病毒及其制備方法和應用，屬于獸藥生物制品技術領域。所述病毒以O/rV病毒株為基本病毒株，包括結構蛋白VP2第98位突變為苯丙氨酸。所述重組病毒的制備方法，在VP2中同時引入了兩個點突變S93F和Y98F，但在病毒傳代過程中穩定保留了Y98F。所述含VP2 Y98F的FMDV O/rV?3具有良好的熱穩定性，且具有良好的免疫效果。本發明構建的含VP2 Y98F耐熱突變株O/rV?3可作為優質滅活疫苗生產種毒，顯著提高滅活疫苗中的有效抗原含量，增加滅活疫苗的免疫效力，用于我國口蹄疫的有效防控。

技術領域

本發明屬于獸藥生物制品技術領域，具體涉及一種熱穩定口蹄疫O型重組病毒及其制備方法和應用。

背景技術

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是嚴重威脅我國畜牧業發展的重大動物疫病。口蹄疫病原-口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，FMDV)在我國長期駐留，引發疫情，不僅嚴重影響了畜牧業的健康發展，造成家畜及其產品的貿易障礙，而且給公共衛生和國家聲譽造成嚴重的負面影響，因此我國十分重視對該病的防控。

FMDV屬于小RNA病毒科，其基因組長約8500個核苷酸，由5'非編碼區(Untranslated Regions，UTR)，一個大的開放閱讀框(Openreading frame，ORF)和3'UTR組成。開放閱讀框編碼一個多聚蛋白，該蛋白經蛋白酶裂解加工后形成4個結構蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和10個非結構蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B1-3、3C和3D)。其中每一分子四種結構蛋白組成一個原體(5S)，每5個原體形成一個五聚體(12S)，12個五聚體組成病毒衣殼(75S)，病毒衣殼和RNA組成FMDV粒子(146S)。研究表明FMDV粒子對環境溫度比較敏感，溫度升高容易誘導病毒粒子解離成五聚體亞單位(12S)而導致疫苗的有效抗原(146S)含量降低，從而影響疫苗的免疫保護效力。因此，改善FMD疫苗的熱穩定性，制備熱穩定的FMD疫苗對于我國口蹄疫的防控具有重要意義。

近年來反向遺傳操作技術的發展為改造病毒提供技術支持，其建立過程是通過在體外進行人工基因操作，使其建立的系統滿足病毒復制和包裝所需要的各種必要條件。但是由于反向遺傳操作可能影響效率，例如成功拯救的重組狂犬病病毒其拯救效率較低，在10⁷個轉染細胞中大約只獲得1個病毒粒子。另外，重組病毒在動物細胞上有效復制產生細胞病變也會影響其拯救效率。同時反向遺傳操作后的病毒后期傳代過程中發生回復突變不能長期穩定保持有益生物學特性。同時現有技術中采用反向遺傳操作技術對病毒的毒力或病毒的產量等生物特性進行改性，目前現有技術中還沒有一套關于熱穩定性口蹄疫O型標記病毒的拯救方案。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于基于FMDV反向遺傳操作提供一種熱穩定口蹄疫O型重組病毒及其制備方法和應用，所述熱穩定口蹄疫O型重組病毒不僅具有較好的遺傳穩定性，而且熱穩定性也顯著提高。

本發明提供的一種熱穩定口蹄疫O型重組病毒，以O/rV病毒株為基本病毒株，包括結構蛋白VP2第98位酪氨酸突變為苯丙氨酸。

優選的，突變后的結構蛋白VP2的氨基酸序列為SEQ ID No.1。

優選的，突變后的結構蛋白VP2的核苷酸序列為SEQ ID No.2。

本發明提供了所述熱穩定口蹄疫O型重組病毒的制備方法，包括以下步驟：

1)利用基因合成技術合成含結構蛋白VP2第93位和98位氨基酸突變均為苯丙氨酸的特定核苷酸序列，插入pUC質粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；

所述結構蛋白VP2第93位和98位氨基酸均突變為苯丙氨酸的核苷酸序列為SEQIDNo.5；