[發明專利]純物理方法制備可注射型脂肪細胞外基質微粒、水凝膠的制備及使用方法

在審

• 申請號: 201910146469.9
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN111617316A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 易成剛;楊劑忠;仇利紅;蘇映軍;熊紹恒;張兆祥
• 申請（專利權）人: 易成剛
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/52
• 代理公司: 西安尚睿致誠知識產權代理事務所(普通合伙) 61232
• 代理人: 何凱英

1.一種純物理方法制備可注射型脂肪細胞外基質微粒的制備方法，其特征在于，

包括如下步驟：

步驟1)：脂肪的收集和處理

通過吸脂技術來獲取人源性或豬源性的脂肪顆粒，將所得到的脂肪顆粒用去離子水(DI water)漂洗，以去除血液成分；利用勻漿機對脂肪進行勻漿，轉速為8000rpm，離心2min；隨后加入蒸餾水或低滲鹽水混勻，靜置20分鐘；

步驟2)：反復凍融操作

將加入蒸餾水或低滲鹽水處理后的脂肪顆粒放置-80℃冰箱2小時，之后取出放置37℃水浴箱中直至完全解凍，反復進行上述步驟5次；

步驟3)：機械乳糜化處理

將步驟二中得到的脂肪顆粒通過內徑為1.0mm的金屬轉換接頭，利用注射器或者是脂肪乳糜化裝置；以10ml/s的均勻速率來回轉移60到120次；

步驟4)：高速離心操作

收集步驟三中的脂肪顆粒裝于離心管當中，用高速離心進行離心操作，得到四層的分層，其從上至下依次包括：

第1層：油脂層，將其提取以便后續步驟五中使用；

第2層：脂肪基質混合層；檢測上述脂肪基質混合層，其中若有細胞成份，將其收集，隨后加入蒸餾水或低滲鹽水混勻，靜置20分鐘，再將步驟2)、步驟3)、步驟4)操作重復一次甚至數次，直至無細胞殘留；收集到脂肪基質混合組織；

第3層：水份層，棄去；

第4層：細胞層，棄去；

步驟5)：高速離心法脫油脂處理

把步驟4)中第1層收集的油脂層，加入脂肪基質混合組織中，再進行步驟3)操作，然后高速離心，絕大部分的油脂析出到上層，予以去除；中層為脂肪基質混合組織保留，下層少量水份可去除；

步驟6)：繼續脫油脂處理

分析步驟5)中的脂肪基質混合組織的油脂含量，如仍有油脂，再重復操作步驟5)，直至檢測不到油脂成分；得到脂肪源性的細胞外基質；

步驟7)：超臨界二氧化碳萃取脫油脂處理

(1)將上述步驟4)中第2層收集到的脂肪基質混合層轉移至超臨界二氧化碳萃取裝置的萃取器內；

(2)首先通過壓力調節器，將壓力調至18～19MPa；通過溫度調節器，將溫度調節至36.5～37.5℃，CO₂的流量調至為23～25L/h；此時二氧化碳處于超臨界流體狀態；將超臨界二氧化碳流體流經萃取器與收集到的脂肪微粒進行接觸反應；

(3)脂質和細胞將與超臨界二氧化碳流體發生溶解反應并隨著流體進入到分離器中，極性強的氨基酸類物質和細胞外基質將滯留在萃取器當中；在分離器當中，將溫度調至32℃以上、壓力控制在7MPa以下，這會使CO2的超臨界狀態恢復到氣體狀態，從而實現CO2與萃取油脂的分離；

(4)超臨界二氧化碳流體通過CO₂液化器液化后被收集與CO₂儲存器當中，以便進行下一次的循環萃取，反復進行多次循環直至將脂肪微粒中的脂質、細胞萃取徹底；

(5)整個過程的持續循環時間約為3小時；得到脂肪源性的細胞外基質；

步驟8)：低溫保存

將步驟6)和步驟7)中得到的脂肪源性的細胞外基質，程序性降溫到－80℃，凍干后用γ射線照射(25～35kGy)消毒；真空放置在密封袋中，并于4℃保存備用。

2.一種利用權利要求1中的脂肪細胞外基質微粒制備脂肪細胞外基質水凝膠的制備方法：

將得到的脂肪細胞外基質微粒在室溫下用胃蛋白酶充分溶解，然后調節pH值為7.4，置于37℃形成脂肪細胞外基質水凝膠。

3.一種利用權利要求2中的脂肪細胞外基質水凝膠的使用方法，其特征在于：

該脂肪細胞外基質水凝膠可通過27g小針頭進行局部注射,可用于面部年輕化及軟組織損傷修復。