[發明專利]一種負載外泌體的復合水凝膠及其制備方法

在審

• 申請號: 201910145974.1
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN109925516A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 謝茂彬;王金恒;陳曉明;周苗
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬口腔醫院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K9/06;A61K47/36;A61K47/46;A61K31/12;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三辰專利事務所(普通合伙) 44227
• 代理人: 范欽正

1.一種負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：外泌體提取、純化：從C57小鼠充間質干細胞培養液中提取外泌體，采用差速超速離心法將得到的外泌體重懸于10mM PBS溶液中，-80℃保存備用；

S2：電轉載藥：將配置好的藥物溶液與步驟S1中的外泌體均勻混合，按電穿孔儀要求及電穿孔皿規格加入相應體積，按照預設電壓參數，進行電穿孔載藥；

S3：孵育：繼步驟S2電穿孔載藥之后將樣品置于細胞培養箱中避光孵育30min，得到混合液；

S4：純化：將步驟S3的混合液以100,000-140,000g離心力超速離心60-100min，取沉淀物，得到負載藥物的外泌體，用10mM PBS重懸沉淀備用；

S5：將透明質酸與高碘酸鈉在無光條件下進行氧化反應24小時，透析后凍干，得到氧化透明質酸；

S6：將步驟S5的氧化透明質酸與步驟S4的負載藥物的外泌體混合后，加入乙二酸二酰肼進行反應，得到負載外泌體的復合水凝膠。

2.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S1中所述C57小鼠充間質干細胞培養液為無外泌體血清或不含血清。

3.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S2中所述電穿孔載藥的條件為：電壓0-350V，脈寬100μs，間隔1000μs，放電次數：0-9次。

4.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述透明質酸的分子量為80kDa-2000kDa。

5.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述透明質酸的濃度為1％(w/v)。

6.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述高碘酸鈉的濃度為2.67％(w/v)，所述高碘酸鈉與所述透明質酸的摩爾比為1:1。

7.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述氧化反應采用乙二醇終止氧化反應；所述透析采用分子截留量為6000-8000的透析袋進行透析。

8.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述氧化透明質酸的結構如式(I)所示：

9.根據權利要求1所述的負載外泌體的復合水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟S6中所述氧化透明質酸的濃度為6-12％(w/v)，所述乙二酸二酰肼的濃度為2-8％(w/v)。

10.一種負載外泌體的復合水凝膠，由權利要求1-9任一項所述的制備方法得到，所述負載外泌體的復合水凝膠的凝膠時間為5-60min。