[發(fā)明專利]檢測(cè)惡性瘧原蟲k13基因突變位點(diǎn)的特異性引物組及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910145380.0
• 申請(qǐng)日: 2019-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN109897901A
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石瑩;王俊賢;田綠波;樊學(xué)軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川國際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 成都弘毅天承知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51230
• 代理人: 白小明

本發(fā)明公開了一種檢測(cè)惡性瘧原蟲k13基因突變位點(diǎn)的特異性引物組，該特異性引物組包括針對(duì)惡性瘧原蟲k13基因的四個(gè)抗性突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的四對(duì)特異性引物；上述四對(duì)特異性引物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)際上是將多對(duì)特有異性引物的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為一對(duì)通用引物的擴(kuò)增，使得各模板的擴(kuò)增效率趨于一致，而不影響各特有異性引物的擴(kuò)增效率，從而達(dá)到真正的高通量檢測(cè)鑒別多種病原體的目的，且上述四對(duì)特異性引物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物的大小具有明顯的區(qū)別，用于準(zhǔn)確判定突變位點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于惡性瘧原蟲青蒿素耐藥基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)惡性瘧原蟲k13基因突變位點(diǎn)的特異性引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，隨著中國國際貿(mào)易、勞務(wù)輸出的日趨頻繁，境外輸入性瘧疾也明顯增多。耐藥性惡性瘧原蟲在全球廣泛分布，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的危害。檢測(cè)輸入性惡性瘧原蟲的相關(guān)突變基因，可以有效的對(duì)輸入性惡性瘧原蟲的抗藥性進(jìn)行早期檢測(cè)，以便及時(shí)控制惡性瘧原蟲的傳播速度和及時(shí)調(diào)整用藥方案，延緩瘧原蟲抗性的產(chǎn)生，延長抗瘧藥物的使用時(shí)間，對(duì)消除惡性瘧原蟲的的工作具有重要的意義。

世界范圍內(nèi)惡性瘧原蟲對(duì)傳統(tǒng)抗瘧藥產(chǎn)生普遍的抗藥性，已成為阻礙全球瘧疾消除進(jìn)程的重要因素^[1]。近幾年來，在東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)青蒿素抗藥性惡性瘧原蟲也為青蒿素類藥物的使用帶來了潛在的威脅^[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲Kelch螺旋體蛋白基因(K13-propeller gene，k13)上位點(diǎn)的突變與惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素抗性的產(chǎn)生緊密相關(guān)^[3]。此后Talundzic等^[4]、Tun等^[5]和Wang等^[6]分別發(fā)現(xiàn)泰國、緬甸以及中緬邊境流行的惡性瘧原蟲株的K13基因多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。Feng等^[7]對(duì)廣西境外務(wù)工回國人員感染的惡性瘧原蟲的研究發(fā)現(xiàn)，K13基因所有突變位點(diǎn)中C580Y突變率最高(2.7％)。當(dāng)K13基因某些位點(diǎn)發(fā)生突變，會(huì)削弱K13-propeller蛋白與受體蛋白的相互作用，導(dǎo)致青蒿素耐藥性的發(fā)生^[3]因此，以檢測(cè)K13基因kelch結(jié)構(gòu)域多態(tài)來預(yù)測(cè)惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性具有理論支撐。

多重PCR和多重?zé)晒釶CR是兩種在多種病原混合感染中應(yīng)用較多的檢測(cè)鑒別技術(shù)。多重PCR需多對(duì)特異性引物組合在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)競(jìng)爭地結(jié)合擴(kuò)增，引物之間會(huì)產(chǎn)生干擾，每多增加一對(duì)引物，其形成復(fù)雜引物二聚體的概率大大增加，敏感性就越低，加之多重PCR產(chǎn)物需通過瓊脂糖電泳才可觀察結(jié)果，難以區(qū)分小于100bp的條帶；而多重?zé)晒釶CR由于探針要標(biāo)記不同波長的熒光基團(tuán)，如標(biāo)記越多，相互會(huì)產(chǎn)生干擾越大，敏感性就越低。多重PCR和多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的目的基因數(shù)量有限，一般只能進(jìn)行2至4重的檢測(cè)，都達(dá)不到真正的高通量快速檢測(cè)和分析多種病原體的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為：多重PCR和多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的目的基因數(shù)量有限，一般只能進(jìn)行2至4重的檢測(cè)，都達(dá)不到真正的高通量快速檢測(cè)和分析多種病原體的目的。本發(fā)明提供一種檢測(cè)惡性瘧原蟲k13基因突變位點(diǎn)的特異性引物組。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種檢測(cè)惡性瘧原蟲k13基因突變位點(diǎn)的特異性引物組，該特異性引物組包括針對(duì)惡性瘧原蟲k13基因的四個(gè)抗性突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的四對(duì)特異性引物；

其中，四個(gè)抗性突變位點(diǎn)分別為：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；四對(duì)特異性引物分別為：Y493H特異性引物、R539T特異性引物、I543T特異性引物以及C580Y特異性引物；

其中，Y493H特異性引物的正向引物序列為：AGGTGACACTATAGAATATGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTACAC，Y493H特異性引物的反向引物序列為：GTACGACTCACTATAGGGAATTTGACGTAACACCACAATTATTTCTTCTAG；