[發明專利]一種PD-L1外泌體的體外快速檢測平臺及檢測方法

在審

• 申請號: 201910145354.8
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN109884315A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 劉筆鋒;陳鵬
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;G01N33/535;G01N21/78;G01N21/64;G01N1/34
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 孫楊柳;曹葆青

本發明公開了一種PD?L1外泌體的體外快速檢測平臺及檢測方法，屬于快速檢測技術領域。檢測平臺包括樣品初濾區、納濾區、顯色物墊區、顯色區和吸水墊區。所述顯色區上的捕獲抗體和顯色物墊區上的顯色物標記抗體中至少有一種為外泌體PD?L1抗體。檢測方法為先將待檢樣品經過初濾膜進行初步過濾，再經過納濾膜進行過濾，得到外泌體；外泌體與顯色物標記抗體特異性地結合，與顯色物標記抗體特異性結合的外泌體再與捕獲抗體結合，形成雙抗體夾心；所述捕獲抗體和顯色物標記抗體至少有一種為外泌體PD?L1抗體。此平臺集成全血分離，外泌體純化以及PD?L1外泌體特異檢測，具有操作方便，檢測快捷，以及成本低等特點。

技術領域

本發明屬于快速檢測技術領域，具體涉及一種PD-L1外泌體的體外快速檢測平臺及檢測方法。

背景技術

外泌體是細胞分泌到胞外微環境中的納米級小囊泡(直徑50-150nm)，在1983首次被發現。但由于分析手段的缺乏，長期以來外泌體被認為是細胞排泄胞內垃圾的工具。隨著分析方法的不斷創新，外泌體分泌的機制逐漸被揭示。現在，科學界主流的觀點認為，外泌體主要參與細胞間的信號傳遞以及作為疾病標記物。2013年諾貝爾生理醫學獎授予了揭示這一領域重大發現的三位杰出科學家。然而，由此引發的外泌體功能研究與未來潛在應用給國際學術界帶來無限遐想。2015年，借助活體成像技術，外泌體等胞外膜泡在體內廣泛傳遞獲得證實；而更激動人心的發現，外泌體正顛覆科學界對癌癥發育的認知：傳統觀點認為，腫瘤轉移是由于原發灶腫瘤細胞通過血液循環系統直接落戶到其他組織。這導致了時下循環腫瘤細胞研究盛況空前；在正常情況下，T細胞鑒別到癌細胞后使癌細胞自動裂解，維持人體的平衡。但是癌細胞表面表達一種特殊的蛋白質(受體)，和T細胞結合，令T細胞產生“錯覺”，認為癌細胞是“無害的”，同時使得T細胞的活性降低，癌細胞獲得自救。這種特殊的蛋白質就是PD-L1(程序性死亡受體-1的配體)。但最新的外泌體分析發現，腫瘤是首先分泌外泌體作為先鋒隊，通過血液循環系統傳送到其他組織，并改造微環境使其適應腫瘤細胞生長后，再排遣腫瘤細胞大軍安營扎寨。這一發現再次刷新或顛覆了我們對癌癥的認識，百年來關于癌癥的“種子”和“土壤”假說終于獲得印證。令人振奮的是，最近陳剛副教授在其研究中發現，腫瘤細胞可通過釋放表面富含PD-L1的外泌體發揮對腫瘤殺傷性T細胞的功能抑制作用，且外周血中PD-L1陽性外泌體的濃度水平與腫瘤大小呈密切正相關(Nature,2018,560(7718):382-386)。因此，開發一種基于外泌體PD-L1蛋白的體外快速檢測平臺及方法，對于腫瘤無創診斷以及實時療效檢測，將具有重要的意義。文獻檢索發現，Blanco-López等人2016年就提出了一種基于試紙條的外泌體檢測平臺，簡單有效，但其外泌體分離仍需超離，費時費力(Journal of Extracellular Vesicles 5(2016):3180；Biosensors andBioelectronics 87(2017):38–45)。檢索專利發現，王國勝等人也提出了一種外泌體即時檢測平臺(申請號201811060763)，其中利用納米芯片技術實現外泌體分離純化，理論可行，但加工和操作復雜，分離芯片如何與試紙條整合也是難點。同時文獻及專利中多數是基于檢測外泌體表面的四跨膜超家族蛋白(CD63/CD9/CD81等)，正常細胞分泌的外泌體表面也攜帶四跨膜超家族蛋白，所以目前大多數外泌體檢測目的是基于外泌體豐度檢測，并不具有特異性。

發明內容

本發明解決了現有技術中外泌體檢測特異性不高、操作不便以及成本高的技術問題。

按照本發明的第一方面，提供了一種PD-L1外泌體的體外檢測平臺，包括：

樣品初濾區：所述樣品初濾區上粘貼有初濾膜，所述初濾膜用于初步過濾樣品，截留所述樣品中直徑大于初濾膜直徑的細胞和/或顆粒物；

納濾區：所述納濾區與所述樣品初濾區連接；所述納濾區上粘貼有納濾膜，所述納濾膜用于分離得到外泌體；