[發(fā)明專利]一組提高血清糖皮質(zhì)激素水平的基因重組人促皮質(zhì)素前體及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910143665.0
• 申請日: 2019-02-28
• 公開（公告）號: CN109824772B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王大勇;武新麗
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學
• 主分類號: C07K14/695
• 分類號: C07K14/695;C12N15/70;C07K19/00;C12N15/62
• 代理公司: 廣州文衡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44535
• 代理人: 許曉明

本發(fā)明涉及四種具有提高血清中糖皮質(zhì)激素水平作用的基因重組人促皮質(zhì)素（ACTH）前體蛋白：ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141，以及這四種前體蛋白的制備方法。ProACTH113包含阿黑皮素原（Pro?opiomelanocortin，POMC）的第105?217位氨基酸多肽鏈，ProACTH72包含POMC的第105?176位氨基酸多肽鏈，ProACTH80包含POMC的第138?217位氨基酸多肽鏈，ProACTH141包含POMC的第77?217位氨基酸多肽鏈；這四種ACTH前體蛋白中均包含ACTH多肽第1至39位氨基酸序列。為便于純化，ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141等四種前體蛋白的N端與腸激酶底物序列（EKst）相連接，利用連有組蛋白標簽的腸激酶體外切除這四種前體蛋白N端連有的多余肽段，產(chǎn)生游離的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141，再利用鎳柱除去連有組蛋白標簽的腸激酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一組促皮質(zhì)素前體蛋白(ProACTH)及其DNA和蛋白質(zhì)的序列，以及這組前體蛋白的制備工藝。

背景技術(shù)

促皮質(zhì)素(Corticotropin)也稱促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種39個氨基酸的多肽類激素，具有調(diào)控GC的合成與分泌，調(diào)節(jié)糖、脂肪、和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝，調(diào)節(jié)心腦血管功能，提高抵抗力，神經(jīng)損傷保護與再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是臨床治療兩歲以下嬰兒驚厥癥的唯一特效藥，該病發(fā)病率0.5％～1％，6～33％的嬰兒驚厥癥患兒在3歲前死亡，70～90％患兒智力發(fā)育緩慢，30％發(fā)展為自閉癥。ACTH也用于紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病急性惡化、腎病綜合征、全身性皮肌炎和結(jié)節(jié)病的治療；還用于銀屑病關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎以及嚴重眼部過敏和炎癥等的輔助治療。ACTH不穩(wěn)定，體內(nèi)半衰期只有不超過15分鐘。目前國內(nèi)臨床應(yīng)用的ACTH主要從動物組織中提取，生產(chǎn)成本相對較高，并且有傳播動物病毒和支原體的潛在風險。本發(fā)明從工程菌中表達制備基因重組ACTH前體蛋白(ProACTH)，具有生產(chǎn)成本低，減少傳播動物病毒和支原體潛在風險等優(yōu)點。

ACTH由阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin，POMC)在絲氨酸蛋白內(nèi)切酶水解作用下產(chǎn)生，對應(yīng)POMC第138-176位氨基酸多肽鏈。POMC中存在多個蛋白酶切位點，本發(fā)明中利用到的包括第76-77位、104-105位、137-138位、176-177位以及217-218位氨基酸殘基之間的酶切位點。本發(fā)明利用以上酶切位點構(gòu)建4種前體蛋白，分別為ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80和ProACTH141。ProACTH113包含POMC的第105-217位氨基酸多肽鏈；ProACTH72包含POMC的第105-176位氨基酸多肽鏈；ProACTH80包含POMC的第138-217位氨基酸多肽鏈；ProACTH141包含POMC的第77-217位氨基酸多肽鏈。構(gòu)建成重組融合表達載體、純化并測定對GC的影響。這些ACTH的前體蛋白均能夠提高動物血清中糖皮質(zhì)激素的水平。

ACTH在人體中最主要的生理和藥理學作用是調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素的合成。ACTH通過激活黑素皮質(zhì)素2型受體(MC2R)發(fā)揮作用。MC2R屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，激活后引起細胞內(nèi)第二信使環(huán)腺苷酸(cAMP)含量增加。cAMP激活蛋白激酶A(PKA)，后者使轉(zhuǎn)錄因子——cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化。磷酸化CREB(p-CREB)調(diào)節(jié)GC合成的關(guān)鍵酶的基因表達，從而發(fā)揮對體內(nèi)GC水平的長時程調(diào)控作用。腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticalhormones，ACH)是腎上腺皮質(zhì)分泌的激素的總稱，它的表達主要受ACTH調(diào)節(jié)。腎上腺皮質(zhì)激素包括GC、鹽皮質(zhì)激素和性激素。GC為甾體類激素，在人體中的主要以皮質(zhì)醇形式存在，具有促進蛋白質(zhì)、糖、脂肪的生物合成和代謝、抗炎和抑制免疫應(yīng)答等作用。由于體內(nèi)GC的合成嚴格受到促皮質(zhì)素的調(diào)控，所以血清中GC的濃度可以作為評價ACTH樣作用的指標。