[發明專利]一種結合通用熒光引物的發夾修飾引物

在審

• 申請號: 201910141427.6
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN109852612A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 肖君華;劉紅紅;湯晨
• 申請（專利權）人: 上海翼和應用生物技術有限公司;東華大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6853;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發明涉及一種結合通用熒光引物的發夾修飾引物、試劑盒以及在單核苷酸多態性檢測中的應用。所述發夾修飾引物包括成發夾序列、通用熒光引物結合序列和特異序列。本發明提供的發夾修飾引物價格低廉且特異性高，運用通用的熒光引物大大降低成本，所需要的其他實驗耗材也廉價易得；一次PCR后進行毛細管電泳，可以直觀的看到基因型結果，縮短檢測周期，提高檢測效率；本發明運用通用型熒光探針，針對不同位點只需要設計發夾引物即可，大大降低研發成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種結合通用熒光引物的發夾修飾引物、試劑盒以及在單核苷酸多態性檢測中的應用。

背景技術

作為近年來最有發展潛力的第三代分子標記，單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism,SNP)在遺傳分析中得到了廣泛應用。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的80％以上。SNP是一種二態的標記，由單個堿基的轉換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列內，也可能在基因以外的非編碼序列上。

目前已經有多種技術檢測單核苷酸的多態性，包括一代測序、二代測序、基因芯片技術、等位基因特異性PCR技術(AS-PCR)、變性高效液相色譜(DHPLC)、質譜檢測技術、高分辨率溶解曲線等。其中等位基因特異性PCR技術(AS-PCR)的優勢在特異性上尤為突出，但在近幾年的實驗中發現根據AS-PCR設計出來的引物特異性雖好，但仍有非特異性擴增，即使在引物中引入錯配，仍然達不到理想效果。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種結合通用熒光引物的發夾修飾引物，以克服現有AS-PCR技術末端堿基易錯配分辨率不高、易產生非特異擴增的缺點。

本發明提供了一種結合通用熒光引物的發夾修飾引物，包括成發夾序列、通用熒光引物結合序列和特異序列，所述成發夾序列與引物3’端部分堿基序列互補配對但突變堿基處裸露不互補配對，所述通用熒光引物結合序列與通用熒光引物的上游引物序列相同，所述特異序列用于與模板結合。

進一步的，所述成發夾序列位于發夾修飾引物5’端，長度為9～15個堿基，該引物在自然狀態下自身形成發夾結構。所述成發夾序列3’端裸露的單個堿基只與特異的堿基互補配對，引物錯配機率大大降低，進一步更準確的區分不同的突變位點。

進一步的，針對同一SNP不同的基因型，一種基因型的通用熒光引物結合序列比另一種基因型的通用熒光引物結合序列長2～4個堿基，且在此區域的3’端一側長出。通用熒光引物能夠與通用熒光引物結合序列的產物互補結合，進行擴增，使產物帶有熒光信號，能夠進行毛細管電泳。

進一步的，所述特異序列位于發夾修飾引物3’端，長度為10～18個堿基。

進一步的，針對同一SNP不同的基因型，一種基因型的特異序列與另一種基因型的特異序列最后一個堿基不同，引入的錯配堿基不同。

進一步的，所述發夾修飾引物對應的下游引物由通用熒光引物下游序列結合區和下游引物依次拼接而成。在PCR時，每一個SNP對應兩種發夾引物和一種下游引物，此時，發夾引物形成競爭關系，有利于形成更高的特異性。

進一步的，通用熒光引物的上游引物5’端的堿基帶有熒光基團標記。所述熒光基團包括FAM、VIC、HEX、ROX、TaxasRed或CY5，優選FAM、HEX。

本發明中，可針對所有基因型均使用一套通用熒光引物，利用巢式PCR的原理，在前幾個循環中，運用發夾引物進行擴增，使產物帶有能與通用熒光引物結合的序列，結合后，進行擴增，為目標區域PCR產物加上熒光信號，使其可以在毛細管電泳平臺上通過檢測熒光信號判斷不同基因型。

本發明在進行多重PCR時，不同位點產物片段不同時，多位點僅需共用一套熒光引物便可實現多個位點的檢測，大大降低了成本、簡化了實驗操作，更易推廣和使用。