[發明專利]一種改良注射混合液制備及使用方法

有效

• 申請號: 201910133030.2
• 申請日: 2019-02-22
• 公開（公告）號: CN109820819B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 嚴繼舟;杜新路;郭會萍;王成輝
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: A61K9/08
• 分類號: A61K9/08;A61K9/00;A61K48/00;A61K31/7105;A61P15/08
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于注射液技術領域，公開了一種改良注射混合液制備及使用方法。改良的注射混合液按比例由轉染脂質體載體、外源質粒和外源miRNAs溶液組成；制備方法包括：將構建的外源質粒使用滅菌的ddH₂O稀釋濃度為500ng/μL；其次將定制的miRNAs使用滅菌的ddH₂O稀釋濃度為20pmoL/μL；然后準備轉染脂質體載體；并按照轉染脂質體載體：Sox9a外源質粒：外源miRNA(可為一種或多種混合物)＝2:1:1的比例配置混合液2～4μL。使用方法采用性腺體外顯微注射結合電轉染。本發明通過向原有的混合液中添加不同比例和不同種類的外源miRNAs，能夠控制6個月斑馬魚精巢和卵巢的分化以及成魚性腺再生。

技術領域

本發明屬于注射液技術領域，尤其涉及一種改良注射混合液制備及使用方法。

背景技術

目前，業內常用的現有技術是這樣的：

過去十年之間，斑馬魚作為多種實驗的載體已經成為一種具有很高研究價值的模型，斑馬魚在進化上更趨近于哺乳動物，和一些哺乳動物比如人類和小鼠具有同源基因。

斑馬魚類在性別分化的過程中展現出一定的可塑性，同時有著很強的調節機制。miRNAs和FSH/cAMP/MAPK/Sox9信號通路可以調節脊椎動物性腺的發育和性別分化，然而具體的調控網絡不清晰，通過一種斑馬魚體外投影注射技術，可以通過外源注射基因對斑馬魚的性腺分化進行調控。

目前已知向6個月的雄性斑馬魚外源注射Sox9a外源基因只會增加精巢中精子的密度，減少精母細胞的數量。這種簡單的注射方法存在了功能性單一，使用范圍局限的缺點。促進性腺增生，特別是卵泡再生的報道不多。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

每次注射的外源基因單一，只能夠向某個方向定向調控斑馬魚精巢的分化情況。

注射單種外源基因時，斑馬魚精巢分化的程度低，效果不顯著。

還沒有很好方法促進卵泡新生。

解決上述技術問題的意義：

本發明提供了一種能夠在一定程度上控制斑馬魚性腺發育和分化的技術，為以后的魚類或哺乳類性腺分化的科學研究提供了一種新的思路和方法。并且對成年魚類繁殖問題提供了一個新的突破口，同時對人類不孕不育的問題也提供了治療方向。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種改良注射混合液制備及使用方法。

本發明是這樣實現的，一種改良注射混合液，所述改良注射混合液由轉染脂質體載體、外源質粒和外源miRNAs溶液組成；

按質量比例轉染脂質體載體：Sox9b外源質粒：外源miRNAs溶液＝＝2:1:1；

所述外源miRNAs溶液為外源miR141、外源miR-734、外源miR430a、外源miR218a中的一種或多種混合物。

進一步，Sox9a+miR430a組合促進精母細胞增生，將構建的外源質粒使用滅菌的ddH₂O稀釋濃度為500ng/μL；再將定制的miRNAs使用滅菌的ddH₂O 稀釋濃度為20pmoL/μL，按照質量比例轉染脂質體載體：Sox9a外源質粒：外源miR430a＝2:1:1的比例配置改良注射混合液。

進一步，Sox9a+miR141+miR734組合促進類卵巢向精巢轉化，將構建的外源質粒使用滅菌的ddH₂O稀釋濃度為500ng/μL；其次將定制的miRNAs使用滅菌的ddH₂O稀釋濃度為20pmoL/μL；按照質量比例轉染脂質體載體：Sox9a 外源質粒：外源miR141：外源miR-734＝4:2:1:1的比例配置改良注射混合液。