[發(fā)明專利]中國石竹的原位雜交方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910130600.2
• 申請日: 2019-02-21
• 公開（公告）號: CN109652507A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 傅小鵬;張曉妮;包滿珠
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種檢測中國石竹花蕾發(fā)育過程中目的基因的原位雜交方法，其特征在于下列步驟：

A、中國石竹花蕾的固定及包埋：將中國石竹的花蕾用EAF固定液進(jìn)行固定，再用梯度乙醇溶液對固定樣品脫水，獲得脫水樣品；將獲得的脫水樣品經(jīng)過梯度二甲苯和乙醇混合液進(jìn)行透明，之后再通過梯度二甲苯和石蠟混合液浸蠟，最后用純石蠟對樣品進(jìn)行包埋；

B、RNA探針的制備：在目標(biāo)基因的特異區(qū)域設(shè)計探針引物，其中的反向引物包含T7啟動子，其序列如SEQ ID NO:1所述，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄和純化，獲得標(biāo)記的RNA探針；

C、中國石竹花蕾的原位雜交：將脫水樣品進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，消化處理；將處理后的樣品進(jìn)行預(yù)雜交、雜交；將雜交后的樣品進(jìn)行封閉洗脫和信號檢測；

上述步驟A中的梯度乙醇溶液由無水乙醇和水組成，溶劑無水乙醇的體積依次由30％增加到100％；

上述步驟A中的中國石竹花蕾的固定和包埋包括以下步驟：

A1、取中國石竹的花蕾，置于EAF固定液中30min，以0.08MPa抽真空30min；

A2、對中國石竹器官和組織進(jìn)行脫水，用乙醇溶液30％、50％、75％、85％、95％、100％對固定樣品進(jìn)行脫水,每次脫水40min，得脫水樣品,置于4℃過夜；

A3、對中國石竹器官和組織進(jìn)行透明、透蠟和包埋處理，將獲得的脫水樣品，按二甲苯和乙醇體積比為0:1、1:3、1:1、3:1、1:0的梯度進(jìn)行透明，每次處理30min，之后再經(jīng)過石蠟和二甲苯體積比為0:1、1:1、1:0梯度溶液，每次處理1h,之后用純石蠟溶液處理3次，每次靜置1h,最后用純石蠟對樣品進(jìn)行包埋；

上述步驟B中的RNA探針的制備包括如下步驟：

B1、RNA探針的引物設(shè)計,選取基因的特異區(qū)域設(shè)計候選RNA探針引物，候選RNA探針長度優(yōu)選為150-350bp；

B2、對RNA探針進(jìn)行擴(kuò)增及純化,在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，并用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；

B3、對RNA探針進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及純化，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：10×NTP labeling mixture 2μl，5×Transcription buffer 2μl，Protector RNase inhibitor 1μl，RNA Polymerase T7 2μl，PCR產(chǎn)物1μg，補(bǔ)水至20μl；混勻，離心，于37℃孕育2h；加DNaseI消化模板DNA，于37℃孕育15min，用0.2M EDTA終止反應(yīng)；

上述步驟C中的中國石竹花蕾的原位雜交包括以下步驟：

C1、對樣品進(jìn)行脫蠟，復(fù)水；

C2、對樣品蛋白進(jìn)行消化；

C3、將消化后的樣品再次固定；

C4、預(yù)雜交和雜交；

C5、將樣品進(jìn)行封閉和洗脫；

C6、對樣品進(jìn)行信號檢測；

上述樣品經(jīng)過切片，脫蠟，復(fù)水處理之后進(jìn)行蛋白消化；終止蛋白消化反應(yīng)利用蛋白酶K混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述蛋白酶K混合液的配制為10μg/ml蛋白酶K、100mMTris PH7.5溶液、50mM EDTA；所述甘氨酸溶液配制為磷酸鹽緩沖液即PBS稀釋20g/mL甘氨酸水溶液至2mg/mL；

將消化后的中國石竹樣品再次固定，即利用3.7％甲醛PBS溶液固定10min；

對再固定的樣品在預(yù)雜交液中進(jìn)行預(yù)雜交，在雜交液中進(jìn)行雜交；所述預(yù)雜交液配制為1×雜交鹽，50％的去離子甲酰胺，2×Denhart’s緩沖液和0.5mg/mL的tRNA混合液；所述的雜交液為預(yù)雜交液和30％硫酸葡聚糖的混合物；

對雜交后的樣品進(jìn)行封閉和洗脫；所述封閉反應(yīng)需用1×blocking solution進(jìn)行封閉；所述洗脫反應(yīng)，需用1×BSA 0.3％Triton X-100進(jìn)行洗脫；

對封閉后的樣品進(jìn)行信號檢測；進(jìn)行信號檢測需經(jīng)過buffer2和1×BSA 0.3％TritonX-100溶液漂洗，再經(jīng)過buffer4顯色1-2天。