[發明專利]一種產殼聚糖酶的重組菌的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201910128764.1
• 申請日: 2019-02-21
• 公開（公告）號: CN109652437B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 江正強;馬帥;楊紹青;劉翊昊;閆巧娟
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/56;C12N9/42;C12N15/31;C12P19/14;C12P19/26
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本發明公開一種產殼聚糖酶的重組菌的構建方法及其應用。本發明將枯草芽孢桿菌殼聚糖酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因在畢赤酵母中共表達，重組菌株經高密度發酵策略高效制備殼聚糖酶。利用該方法制備殼聚糖酶的酶活力高達50000U/mL以上，蛋白含量為高達16.0mg/mL。重組酶比酶活力為4065.7U/mg，最適pH為6.0，最適溫度為55℃。利用該酶水解高濃度(≥10％)殼聚糖制備殼寡糖，殼寡糖得率大于75％，主要產物為二糖、三糖和四糖。本發明的殼聚糖酶制備方法產酶水平遠遠高于現有文獻和專利的報道，且所產酶具有優異的水解特性，在工業生產殼聚糖酶及制備殼寡糖中具有很好的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種產殼聚糖酶的重組菌的構建方法及其應用。

背景技術

殼聚糖是幾丁質部分脫乙酰的產物，由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵隨機連接而成的直鏈天然多糖。殼聚糖酶(EC3.2.1.132)是專一水解殼聚糖的酶類，從殼聚糖鏈中隨機切割β-1,4-糖苷鍵，產物為殼寡糖及氨基葡萄糖。基于其序列同源性，殼聚糖酶被劃分為糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)5、7、8、46、75和80家族(Thadathil et al.Food Chemistry,2014,150:392–399)。

近年來已有許多微生物產殼聚糖酶的文獻和專利報道，但是大多數產酶水平偏低，難以用于工業化生產，僅一些微生物產殼聚糖酶的水平較高。如專利CN102399727A公開了一種枯草芽孢桿菌利用魔芋粉為碳源產殼聚糖酶的方法，酶活力為11762U/mL。Chen等將煙曲霉殼聚糖酶基因在巴斯德畢赤酵母中異源表達，酶活力為25000U/mL(Chen etal.Biotechnology Letters,2012,34:689-694)，這是目前已報道殼聚糖酶的最高產酶水平。

巴斯德畢赤酵母作為一種成熟、高效的表達系統，已廣泛用于生產各種異源蛋白，高細胞密度發酵是獲得高產量重組蛋白的有效方法。然而，高細胞密度培養需要大量氧氣，致使甲醇誘導期間容易形成溶氧限制，并且由于生物量和消泡劑的增加，氧氣的溶解度和傳質效率逐漸降低，影響細胞生物量及目的蛋白的表達量(Yang et al.,BiotechnologyAdvances,2017,36(1):182-195)。透明顫菌(Vitreoscillastercoraria)血紅蛋白能夠促進氧氣輸送從而改善細胞呼吸和能量代謝。已有研究將其與半乳糖苷酶、磷脂酶等共表達改善高密度發酵時的溶氧限制問題，使細胞生物量和目的蛋白表達量大幅度提高(Wu etal.,Journal of BioscienceBioengineering,2012,113:332-337；Wang et al.,Enzymeand Microbial Technology,2012,50:22-28)。雖然許多殼聚糖酶基因被克隆表達，但未見利用共表達透明顫菌血紅蛋白以提高殼聚糖酶表達水平的相關文獻及專利報道。