[發明專利]一種DNA構建物以及DNA體外拼接方法

在審

• 申請號: 201410235720.6
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN105331604A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 王金;趙國屏;劉家坤;陳威華
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/10;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12N5/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種用于遺傳改造的構建物以及DNA體外拼接方法。

背景技術

DNA合成和組裝技術的突破極大地推動了合成生物學領域的進展，而隨著合成生物學的深入發展，對DNA合成和組裝技術也提出了更多的挑戰和要求。生物磚塊標準化組裝技術的出現，受到了合成生物學界的廣泛應用和歡迎，極大簡化了遺傳回路構建過程中的思路設計和工作量。

合成生物學的核心概念“工程化、標準化、模塊化”在生物磚塊(BioBricks^TM)這個拼接標準上得到了很好的體現和傳播。尤其是建立在生物磚塊庫基礎上的IGEM國際競賽不僅傳播了合成生物學的思想，而且促進了合成生物學的開源共享，激發了青年學生對合成生物學的想象力。將DNA的生物功能元件進行表征后并建立標準化的接口形成的生物磚塊，在構建基因回路的時候不僅技術操作上非常簡便，更重要的是這種設計具備指數增長的組合潛能，不僅大大簡化了基因回路構建中的設計和工作量，而且使得從簡到繁構建越來越復雜的基因回路成為可能。相比于傳統的克隆構建過程，生物磚塊的組合潛能和層級組裝策略受到了合成生物學界的廣泛歡迎，降低了基因回路構建的技術門檻，使得越來越多的復雜設計不斷涌現。

鑒于生物磚塊組裝技術的重要性，很多生物磚塊組裝技術的變種也陸續開發出來了，滿足不同組裝標準要求的文庫構建工作也在開展。這些技術各有特點，最常用的生物磚塊組裝技術因為具有最長的開發時間和廣泛的影響力，積累了最豐富的生物磚塊文庫(Shetty,Endyetal.2008；Kelly,Rubinetal.2009)。例如，BglBrick生物磚塊組裝技術因為接口選擇的疤痕更合理，在融合蛋白的組裝上更有優勢(Lee,Krupaetal.2011)。最近，隨著復雜基因回路構建的興起，更多組裝技術被開發出來。基于typeIIS限制性內切酶的生物磚塊組裝技術在開發和推廣的過程中(Sarrion-Perdigones,Falconietal.2011；Weber,Engleretal.2011)。基于末端同源片段來進行組裝的In-Fusion技術，Gibson技術也運用到生物磚塊的組裝中了(Sleight,Bartleyetal.2010；Siuti,Yazbeketal.2013；SleightandSauro2013)。針對復雜基因回路經常需要進行調試，能夠進行拼接后修飾的Bioscaffold和迭代組裝技術也被開發出來(Norville,Derdaetal.2010；Litcofsky,Afeyanetal.2012)。

目前，生物磚塊的組裝技術還有一些不足之處和很大的改進空間。例如，生物磚塊組裝過程中需要循環利用選定好的II型同尾限制性內切酶，這就要求在構建生物磚塊標準化接口的時候去除生物磚塊內部的酶切位點。目前主要是通過從頭合成DNA的時候通過密碼子替換去除末端用來拼接的酶切位點或者通過PCR同義突變的方式來去除生物磚塊內部的酶切位點。從頭合成，不僅價格昂貴，速度慢，而且部分DNA序列經過改變之后有可能會影響該段DNA序列的功能；而通過PCR同義突變時，不僅工作量巨大(特別是針對一些較大的生物磚塊)，而且也會對該段DNA的功能帶來不確定的影響。同時，這種要求限制了生物磚塊組裝技術的通用性，使得一些實驗室自有的生物功能元件在沒有去除內部酶切位點之前，不能通過標準化的接口技術來進行層級組裝。

發明內容

本發明的目的在于提供一種DNA構建物及其應用。

本發明的另一目的是提供一種體外拼接DNA的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種DNA構建物，所述DNA構建物含有結構如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha為第一歸位內切酶酶切位點；C為待拼接的核酸序列；Hb為第二歸位內切酶酶切位點；

其中，所述第一歸位內切酶和所述第二歸位內切酶為不同種類的同尾歸位內切酶。

在另一優選例中，所述歸位內切酶(Homingendonuclease)選自：I-SceI和PI-PspI。

在另一優選例中，所述式I中所述Ha為I-SceI酶切位點；所述Hb為PI-PspI酶切位點。

在另一優選例中，所述式I中所述Ha為PI-PspI酶切位點；所述Hb為I-SceI酶切位點。

在另一優選例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、編碼基因序列、抗生素生物合成基因簇、負責接合轉移轉移的元件或有特定功能的DNA序列。