[發明專利]一種DNA構建物以及DNA體外拼接方法

在審

• 申請號: 201410235720.6
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN105331604A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 王金;趙國屏;劉家坤;陳威華
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/10;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12N5/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

1.一種DNA構建物，其特征在于，所述DNA構建物含有結構如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha為第一歸位內切酶酶切位點；C為待拼接的核酸序列；Hb為第二歸位內切酶酶切位點；

其中，所述第一歸位內切酶和所述第二歸位內切酶為不同種類的同尾歸位內切酶。

2.如權利要求1所述的構建物，其中，所述歸位內切酶選自：I-SceI和PI-PspI。

3.如權利要求2所述的構建物，其特征在于，所述I-SceI酶切位點包含選自下組的核酸序列：

(a)5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’和/或其反向互補序列；

(b)將(a)中的核酸序列經過一個或多個核苷酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠被I-SceI酶識別的由(a)衍生的核酸序列。

4.如權利要求2所述的構建物，其特征在于，所述PI-PspI酶切位點包含選自下組的核酸序列：

(a)5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’和/或其反向互補序列；

(b)將(a)中的核酸序列經過一個或多個核苷酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠被PI-PspI酶識別的由(a)衍生的核酸序列。

5.一種載體，其特征在于，所述載體包含權利要求1所述的構建物。

6.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞的基因組的一個或多個位點整合有權利要求1所述的構建物，或者所述宿主細胞中含有權利要求5所述的載體。

7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含的試劑選自下組中的一種或多種：

(a)權利要求1所述的構建物；

(b)權利要求5所述的載體；

(c)權利要求6所述的細胞；

(d)I-SceI內切酶或I-SceI內切酶表達載體；和

(e)PI-PspI內切酶或PI-PspI內切酶表達載體。

8.如權利要求1所述的構建物、權利要求5所述的載體、權利要求6所述的細胞或權利要求7所述試劑盒的用途，其特征在于，用于細胞基因組的遺傳改造和/或用于基因回路的構建。

9.一種DNA體外拼接方法，其特征在于，包括步驟：

(1)提供含有第一構建物的第一載體，所述第一構建物含有結構如式Ia所示的第一核酸序列，

Ha-Ca-HbIa

式中Ha、Hb的定義如權利要求1中所述，Ca為第一待拼接的核酸序列；

(2)使用第二歸位內切酶酶切所述載體的第二歸位內切酶酶切位點，形成線性化的第一酶切產物；

(3)提供第二構建物，所述第二構建物含有結構如式Ib所示的第二核酸序列，

Ha-Cb-HbIb

式中Ha、Hb的定義如上所述，Cb為第二待拼接的核酸序列；

并對所述第二構建物用第一歸位內切酶和第二歸位內切酶進行雙酶切，形成經酶切的第二酶切產物；

(4)將第二酶切產物與所述的第一酶切產物進行連接反應，從而形成含有式II所示的拼接序列的載體：

Ha-Ca-Scar-Cb-HbII

式中，Ha、Hb、Ca、和Cb的定義如上所述，而Scar為拼接過程中所形成的拼接接頭序列。

10.如權利要求9所述的方法，其中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、編碼基因序列、抗生素生物合成基因簇、負責接合轉移轉移的元件或有特定功能的DNA序列。