[發明專利]羊齒天門冬超低溫培養方法

在審

• 申請號: 201910113311.1
• 申請日: 2019-02-13
• 公開（公告）號: CN109673515A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 繆劍華;李翠;張占江;韋坤華
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

1.羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，包括：室溫下將培養在預培養液中的長度為1-2mm的羊齒天門冬莖尖置于搖床振蕩器中避光黑暗培養1-3d后，用裝載液處理20-60min，取出羊齒天門冬莖尖轉入溫度為0℃的玻璃化溶液中脫水30-50min后放入凍存管中，再將凍存管存于液氮中進行超低溫保存。

2.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，還包括：將凍存管從液氮中取出，吸除玻璃化溶液，用卸載液洗滌羊齒天門冬莖尖1-3次后，轉入恢復培養基進行復蘇培養。

3.如權利要求2所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，在吸除玻璃化溶劑后，先將羊齒天門冬莖尖置于35-45℃的水浴中浸泡1-5min，再用卸載液洗滌羊齒天門冬莖尖1-3次后，又用無菌水清洗羊齒天門冬莖尖的表面，最后轉入恢復培養基進行復蘇培養。

4.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，預培養液為MS培養液，其包括質量分數為5％的DMSO、1.0mg/mL的6-BA、0.5mg/mL的NAA。

5.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，裝載液包括以下成分：MS、2mol/L的丙三醇、0.4mol/L的蔗糖。

6.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，玻璃化溶液包括：MS、質量分數為30％的丙三醇、質量分數為15％的DMSO、質量分數為15％的乙二醇、0.4mol/L的蔗糖。

7.如權利要求2或3所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，卸載液包括：MS、1.0mol/L的蔗糖；恢復培養基包括：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/mL的NAA。

8.如權利要求2或3所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，復蘇培養時先在黑暗條件下培養3d，然后轉入光照培養7d，光照時間為12h/d，光照強度為1800lux，溫度為25℃，濕度為40％。

9.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，脫水時在脫水裝置中進行，所述脫水裝置包括用于容納0℃的玻璃化溶液的第一容器和用于容納羊齒天門冬莖尖的第二容器，其中，

所述第一容器為頂部敞開的長方體形殼體，所述第一容器水平放置，所述第一容器的內部卡設凹面朝上的弧形隔板，所述弧形隔板的兩條線性邊分別與所述第一容器頂部的寬邊密封以將所述第一容器分隔為位于上方的弧形槽和位于下方的密閉空腔，所述密閉空腔內填充超細玻璃棉；

所述第二容器包括支架、轉軸、連接桿、容納殼，所述支架位于所述第一容器外側，所述轉軸可轉動的水平設置在所述支架上，所述轉軸通過電機驅動，所述連接桿的一端固接在所述轉軸上、另一端與所述容納殼的頂部固接，所述容納殼為底部具有進樣口的球體結構，所述容納殼上間隔設有四個進液孔，其中兩個進液孔靠近所述容納殼的頂部并關于所述轉軸對稱，剩余兩個進液孔靠近所述進樣口并關于所述轉軸對稱，所述容納殼的內壁上貼附海綿，所述海綿不遮擋四個進液孔，所述容納殼不與所述弧形隔板接觸，所述進樣口可拆卸地設有蓋體，所述蓋體上固設固定柱，所述固定柱的頂端固設頂部敞開的載物筒，所述固定柱和所述載物筒均位于所述容納殼內，所述載物筒的頂部頂抵所述容納殼內的海綿，所述載物筒的側壁上間隔設有多個通孔，任意一個通孔的軸線均與任意一個進液孔的軸線垂直；當所述容納殼位于所述弧形槽的正中央時，所述連接桿、所述載物筒、所述固定柱在豎直方向同軸設置，

其中，所述弧形槽內盛裝0℃的玻璃化溶液，所述載物筒內容納羊齒天門冬莖尖，所述弧形槽內盛裝的0℃的玻璃化溶液浸沒所述容納殼，當0℃的玻璃化溶液通過四個進液孔、多個通孔充滿所述載物筒后，所述電機控制所述轉軸先順時針轉動四分之一圈，再逆時針轉動四分之一圈，以使所述容納殼在弧形槽內擺動直到脫水結束，且所述容納殼始終浸沒在玻璃化溶液中。

10.如權利要求1所述的羊齒天門冬超低溫保存培養方法，其特征在于，羊齒天門冬莖尖在用裝載液處理前還進行了如下處理：先將羊齒天門冬莖尖從搖床振蕩器中取出，置于蒸餾水中浸泡30s，再將羊齒天門冬莖尖置于吸水紙上，用兩層紗布覆蓋，正對紗布噴灑質量分數為0.5％的氯化鈉水溶液0.5mL靜置1min，再噴灑5ppm的脫落酸0.3mL靜置1min，用蒸餾水沖洗羊齒天門冬莖尖的表面，然后用裝載液處理。