[發明專利]一種單鏈分子標簽接頭及單鏈DNA建庫方法及其在檢測循環腫瘤DNA中應用

在審

• 申請號: 201910110142.6
• 申請日: 2019-02-11
• 公開（公告）號: CN109797197A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 林志偉;莫凡;羅凱;鄭文淵;韓寧;陳樞青
• 申請（專利權）人: 杭州紐安津生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/11;C12N15/10;C40B80/00;C12Q1/6886
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 姚宇吉

1.一種單鏈分子標簽接頭，其特征在于，包括：14個堿基配對形成的莖結構、測序引物序列、和8個隨機核苷酸組成的分子標簽序列，其中測序引物序列與莖結構序列之間插入了一位堿基為“U”脫氧尿嘧啶核苷，該單鏈核酸序列經退火變性會形成莖環結構。

2.一種單鏈DNA建庫方法，其特征在于，包括如下步驟：

3’末端接頭的制備；

5’末端接頭的制備；

樣本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及變性處理：高溫處理，將原來雙鏈的DNA變性為單鏈DNA；

3’端接頭連接：將單鏈DNA產物和3’端雙鏈DNA接頭進行堿基配對，并頭進行連接反應；

3’端接頭連接鏈霉親和素：將連接反應得到的連接產物通過鏈霉親和素磁珠進行吸附，固定在鏈霉親和素磁珠上；

延伸：將連接過鏈霉親和素的單鏈連接產物為模板，將3’末端接頭作為引物進行延伸，獲得雙鏈DNA產物；

5’端接頭連接：將雙鏈DNA產物和5’端雙鏈DNA接頭進行分子間的雙鏈連接；

鏈霉親和素清洗及文庫洗脫回收。

3.根據權利要求2所述的一種單鏈DNA建庫方法，其特征在于，

3’末端接頭的制備的具體過程如下：

制備PCR試劑，PCR試劑的配方包括：

用移液器將PCR試劑混勻，瞬時離心將樣品收集至管底，再將樣品置于PCR儀中，PCR程序如下：

95℃ 1min，

95℃-10℃ -0.1℃/sec，

10℃ 5min。

4.根據權利要求3所述的一種單鏈DNA建庫方法，其特征在于，

所述上鏈序列采用CL78(SEQ ID NO.1)，序列為：

5’Pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10-TEG-biotin3’，該接頭序列5’端磷酸化修飾，3’端生物素化修飾，中間引入10個C3相隔臂和TEG分子；

所述下鏈序列采用CL93(SEQ ID NO.2)，序列為：

5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC7 3’，該接頭序列5’端采用amino linker C12修飾，3’端含有6個隨機核苷酸組成簡并堿基，且末端amino linker C7修飾；

所述下鏈序列采用CL106(SEQ ID NO.3)，序列為：

5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC3 3’，3’端含有6個隨機核苷酸組成簡并堿基，且末端amino linker C3修飾；

所述下鏈序列采用CL110(SEQ ID NO.4)，序列為：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中間含有aminolinker C12修飾，3’端含有8個隨機核苷酸組成簡并堿基，且末端amino linker C6修飾；

所述下鏈序列采用CL136(SEQ ID NO.5)，序列為：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中間含有aminolinker C12修飾，3’端含有7個隨機核苷酸組成簡并堿基，且末端amino linker C6修飾；

所述下鏈序列采用CL137(SEQ ID NO.6)，序列為：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中間含有aminolinker C12修飾，3’端含有8個隨機核苷酸組成簡并堿基，且末端amino linker C6修飾。

5.根據權利要求2所述的一種單鏈DNA建庫方法，其特征在于，

5’末端接頭的制備的具體過程如下：

PCR試劑包括：

用移液器將PCR試劑混勻，瞬時離心將樣品收集至管底，再將樣品置于PCR儀中，PCR程序如下：

95℃ 1min，

95℃-14℃ -0.1℃/sec，

14℃ 5min。