[發明專利]常溫下一種糞便樣本的DNA保存液及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201910101292.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109609600A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 楊忠麗;桂小華;杜文娟;李晶晶;袁文佶;李明定
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發明公開了常溫下一種糞便樣本的DNA保存液及其配制方法和用途。此保存液的主要成分包括以下幾種：三羥甲基氨基甲烷(Tris?HCl)緩沖液、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA?2Na)、氯化鈉(NaCl)和十二烷基硫酸鈉(SDS)。該配方的優點是在常溫下可以穩定糞便樣本中微生物的構成，而且操作簡便，只需將采集的新鮮糞便樣本浸入此保存液中即可。本發明可用于常溫條件下大規模的樣本收集和運輸。

技術領域

本發明屬于微生物樣本保藏領域，具體涉及常溫下一種糞便樣本的DNA保存液及其制備方法和用途。

背景技術

近年來，隨著第二代測序技術的發展和生物信息學分析方法的日益完善，已證明腸道微生物與多種疾病的發生發展密切相關。其中以16S rDNA技術為代表，16S rDNA存在于所有細菌染色體基因中，可以編碼16S rRNA相對應的DNA序列，該序列包含9個高變區和10個保守區。保守區反映了生物物種間的親緣關系，而高變區則能體現物種間的差異。通過設計引物擴增高變區的序列，然后進行二代測序，運用生物信息學分析方法進一步區分菌種。目前此方法廣泛應用于菌種的鑒定。

人體內存在著比體細胞數高達數十倍甚至上百倍的微生物，其廣泛分布在口腔、消化道、呼吸道、皮膚表面、生殖道以及腸道。其中腸道是人體最大的微生態系統，寄宿著約10¹⁴個微生物。從功能上可將這些微生物分為三大類：益生，共生和病原微生物，其中以細菌為主，也包括真菌、病毒和噬菌體，它們在腸道內維持著一個動態平衡。人體糞便的采集是反映腸道微生物和健康狀況的最直接方式。盡管腸道微生物的構成是相對穩定的，但隨著年齡階段的不同、飲食習慣和生活方式以及健康狀況的改變，微生物菌群也會發生很大的變化。因此，定期檢測腸道微生物構成的改變可以有效監測人體的健康狀況。

由于人體腸道為微生物提供了最適宜的生長環境，一旦脫離人體后，大多數微生物的增長與死亡速率會發生很大的改變，不能準確的反映機體的健康狀況。目前通用的保存方法是將采集好的糞便樣本立即低溫凍存，尤其是-80℃的凍存效果較好。然而此方法實用性較差，除了專業機構外，一般沒有低溫設備可供保存樣本。因此，尋求一種可以穩定微生物構成的保存方法尤為重要。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題是克服目前低溫保存方法的缺陷，從而提出一種操作簡便，可長期常溫保存及運輸的保存液。受檢者可任何時候完成樣品的采集，只需將樣品浸入此保存液中就可達到穩定微生物構成的目的。

本發明所采用的技術方案如下：常溫下一種糞便樣本的DNA保存液的制備方法，該方法為用無菌水溶解20-50mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液、10-50mM的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、100-150mM的氯化鈉(NaCl)和質量分數為0.1％-0.5％的十二烷基硫酸鈉(SDS)，再調制PH至8.0，最后獲得DNA保存液。

進一步的，所述三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液的摩爾濃度為40mM。

進一步的，所述乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)的摩爾濃度為45mM。

進一步的，所述氯化鈉(NaCl)的摩爾濃度為140mM。

進一步的，所述十二烷基硫酸鈉(SDS)的質量分數為0.3％。

本發明還提供由上述的制備方法制備得到的DNA保存液。

本發明還提供由上述制備方法制備得到的DNA保存液在常溫下保存糞便樣本DNA中的用途。

與現有的低溫保存方法相比，上述所述保存液具有以下優點：可長期常溫放置及運輸，且操作簡便，只需將糞便樣本浸入上述保存液中即可達到穩定微生物構成的目的。上述保存液大大地改善了實用性能，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1是不同處理方式的樣本DNA凝膠電泳結果；