[發明專利]一種重組蛋白gp32-UvsX、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201910097760.1
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109957029B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 劉淑園;陳華云;孫康莉;張天海
• 申請（專利權）人: 廣州和實生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12Q1/6844;C12N9/24
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 朱本利

本發明提供了一種重組蛋白gp32?UvsX，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。同時還提供了一系列重組蛋白gp32?UvsX的突變體。本發明通過將蛋白酶gp32與UvsX的基因拼接，形成新的重組蛋白gp32?UvsX，該系列重組蛋白同時具備結合單鏈和重組的功能，可以與Bst、Taq等DNA聚合酶實現核酸體外擴增。本發明將重組酶和gp32結合單鏈的功能聚合到同一個酶上，只需一對引物即可進行擴增；而且本發明的酶不但可以應用到恒溫擴增，還可以用到普通PCR上，擴大了酶的用途，提高了酶的耐受溫度。經過本發明的改進，提高了酶的活力，改良了酶的性能，使酶具有高效性和專一性；可加速化學反應，快速達到平衡點；達到改善實驗進程、保留實驗效果的目的，給核酸體外擴增帶來新方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種重組蛋白gp32-UvsX、其制備方法及應用。

背景技術

恒溫擴增技術是繼PCR技術后發展起來的一門新型的體外核酸擴增技術。目前主要的恒溫擴增技術有：滾環核酸擴增、環介導等溫擴增、鏈替代擴增、依賴核酸序列擴增和解鏈酶擴增。均可在23-45℃下連續進行反應，反應時間為15-30min，它們都具有共同的特點：特異性強、靈敏度高，不需要特殊的儀器設備。

UvsX是一種重組酶，在恒溫PCR過程中與上游引物或下游引物相結合形成重組酶引物復合體，上游引物與重組酶復合體可以正向掃描DNA模板，下游引物重組酶復合體反向掃描雙鏈DNA模板。一旦找到，重組酶就可以使此位置的靶序列雙鏈DNA解鏈，并發生鏈置換反應，形成D形環結構。這時，單鏈結合蛋白gp32與被置換單鏈結合，防止置換的單鏈被進一步替換。

gp32蛋白是一種單鏈DNA(ssDNA)結合蛋白，在恒溫基因擴增過程中結合單鏈DNA，協調性地結合并穩定瞬時形成的ssDNA區域。由于恒溫技術不需要高溫解鏈，而是通過gp32的單鏈結合作用，使DNA雙鏈被打開時繼續保持單鏈狀態，從而降低非特異。普通PCR主要是通過高溫裂解，降低非特異，所以gp32在恒溫PCR中是必不可少的蛋白。

而恒溫基因擴增技術僅適用于恒溫擴增，主要原因是gp32的最適反應溫度受限，例如DNA擴增試劑盒適用溫度在37℃-42℃范圍內，過低或過高的溫度會使制劑中的酶溫度的影響而逐漸地失去全部活性，對反應體系產生不利的影響。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺陷，本發明通過把UvsX(重組)和gp32蛋白(單鏈結合)兩個酶的功能合并在一起，減少了加入物質的繁瑣程序，降低了成本，減少了酶的定標過程，有助于酶在生產上放大。

為了實現本發明的目的，本發明提供了一種重組蛋白gp32-UvsX的編碼氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。本發明將重組酶和gp32單鏈結合的功能聚合到同一個酶上，只需一對引物即可進行擴增，而且本發明的酶不但可以應用到恒溫擴增，還可以用到普通PCR上，擴大了酶的用途，提高了酶的耐受溫度。

優選地，重組蛋白gp32-UvsX的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明還提供了一種重組蛋白gp32-UvsX的制備方法，包括以下步驟：

(1)將重組蛋白gp32-UvsX的基因表達片段導入載體，得到重組表達載體，所述重組基因片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)將所述載體轉入大腸桿菌，得到重組工程菌；

(3)對所述重組工程菌進行誘導培養后進行分離純化，得到所述重組蛋白gp32-UvsX，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

進一步地，在所述重組蛋白gp32-UvsX的制備方法步驟(1)之前還包括以下步驟：